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Varios métodos de análisis


Enviado por   •  20 de Septiembre de 2011  •  Monografías  •  2.750 Palabras (11 Páginas)  •  636 Visitas

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reaccionará posteriormente para producir una modificación covalente en lo que se denomina el "complejo del punto muerto" EI*. La tasa a la cual se forma EI* es llamada tasa de inactivación o kinact. Puesto que la formación de EI puede competir con ES, la unión de los inhibidores irreversibles puede ser prevenida por competencia tanto con el sustrato como con un segundo inhibidor reversible. Este efecto de protección es una buena evidencia de una reacción específica del inhibidor irreversible con el sitio activo.

Los pasos de unión e inactivación de esta reacción son analizados incubando la enzima con el inhibidor y midiendo la actividad que va quedando a lo largo del tiempo. La actividad irá disminuyendo de forma paulatina con tiempo, generalmente siguiendo una dinámica de decaimiento exponencial. Ajustando estos datos a una ecuación de rango podemos obtener la tasa de inactivación a esta concentración de inhibidor. Esto se hace a diferentes concentraciones de inhibidor. Si un complejo EI reversible está involucrado el rango de inactivación será saturable y al ajustarla a esta curva obtendremos los valores de kinact y Ki.[16]

Otro método que es ampliamente utilizado en estos análisis es la espectrometría de masas. En este caso, la medida exacta de la masa de la enzima nativa sin modificar y de la enzima inactivada, nos da el aumento en la masa causado por la reacción con el inhibidor, con lo que obtenemos la estequiometría de la reacción.[17] Para llevar a cabo esta técnica suele ser necesario el uso de un espectrómetro de masas MALDI-TOF. Una técnica complementaria a esta es la huella peptídica, que implica la digestión de proteínas nativas o modificadas con una peptidasa como la tripsina. Esto genera una serie de péptidos que pueden ser analizados usando un espectrómetro de masas. El péptido que cambie su masa después de llevar a cabo la reacción con el inhibidor será aquel que contenga el sitio de la modificación.

[editar] Casos especiales

Mecanismo químico para inhibición irreversible de la ornitina descarboxilasa por medio de DFMO. El piridoxal 5'-fosfato (Py) y la enzima (E) no se muestran.[18] (Adaptado del artículo que figura en la referencia).

No todos los inhibidores irreversibles forman uniones covalentes con la enzima que tienen como diana. Algunos inhibidores reversibles se unen tan fuertemente a su objetivo que son prácticamente irreversibles. Estos inhibidores de unión fuerte suelen mostrar una cinética similar a la de los inhibidores irreversibles que forman enlaces covalentes. En estos casos, algunos de estos inhibidores se unen rápidamente a la enzima formando un complejo EI de baja afinidad, que después experimenta una reacción más lenta hacia un complejo EI* muy fuertemente unido (ver la imagen arriba). Este comportamiento cinético es denominado unión lenta.[19] Este lento reajuste posterior normalmente implica un cambio conformacional cuando la enzima se pliega alrededor de la molécula inhibidora. Como ejemplos de inhibidores de unión lenta cabe destacar algún fármaco importante como el metotrexato,[20] el alopurinol[21] y la forma activada del aciclovir.[22]

[editar] Ejemplos de inhibidores irreversibles

Tripanotión reductasa donde se muestran dos moléculas unidas al centro activo: la inferior es un inhibidor unido de forma irreversible y la superior un inhibidor unido de forma reversible. Creado mediante PDB 1GXF.

El diisopropilfluorofosfato (DFP) se muestra como un ejemplo de inhibidor irreversible de la proteasa en el apartado "Inhibidores irreversibles" arriba a la derecha. La enzima hidroliza el enlace entre el fósforo y el flúor, pero el residuo de fosfato se mantiene unido a una serina en el centro activo, inactivándolo.[23] Además, el DFP también reacciona con el centro activo de la acetilcolinesterasa en la sinapsis de las neuronas, lo que lo convierte en una potente neurotoxina, con una dosis letal a partir de cantidades inferiores a 100 mg.[24]

La inhibición suicida es un tipo común de inhibición irreversible donde la enzima convierte al inhibidor en una sustancia reactiva en su centro activo. Un ejemplo de esto es el inhibidor de biosintetizadores de poliaminas α-difluorometilornitina o DFMO, que es un análogo del aminoácido ornitina, y es usado para tratar la Tripanosomiasis Africana (enfermedad del sueño). La ornitina decarboxilasa puede catalizar la descarboxilación del DFMO sustituyendo a la ornitina, como se muestra en la figura del apartado anterior. Sin embargo, esta reacción de descarboxilación es seguida por la eliminación del átomo de flúor, lo que convierte a este intermediario en una imina, una especie altamente electrofílica. Esta forma reactiva del DFMO reacciona posteriormente con un residuo de cisteína o lisina en el centro activo para inactivar la enzima irreversiblemente.[18]

Puesto que la inhibición irreversible implica a menudo la formación inicial de un complejo EI no covalente, a veces es posible que un inhibidor pueda unirse a una enzima de diversas formas. Como ejemplo cabe destacar el caso de la enzima tripanotión reductasa perteneciente al protozoo y parásito humano Trypanosoma cruzi, donde dos moléculas de un inhibidor llamado mostaza quinacrina, presentan la capacidad de unirse a su centro activo. La molécula superior se une de forma reversible, pero la de abajo se une de forma covalente al reaccionar con un residuo de aminoácido a través de su grupo de mostaza nitrogenada.[25]

[editar] Descubrimiento y diseño de inhibidores

La investigación y desarrollo de nuevos fármacos es un largo proceso en el cual el primer paso casi siempre es el descubrimiento de un nuevo inhibidor enzimático. En el pasado, la única forma de descubrir estos nuevos inhibidores era mediante el sistema de prueba y error: probando un elevado número de compuestos contra la enzima a la cual se quiere inhibir y esperando conseguir alguno que sea efectivo. Esta aproximación, si bien se basa en la fuerza bruta, sigue logrando actualmente un gran éxito gracias a nuevos sistemas de barrido, como la química combinatoria, que rápidamente producen un gran número de compuestos novedosos, y a la tecnología basada en la investigación de procesamiento de alto-rendimiento, mediante la cual se pueden revisar rápidamente estas enormes bibliotecas químicas de inhibidores útiles.[26]

Más recientemente, se ha comenzado a aplicar un nuevo tipo de investigación alternativa: el diseño racional de fármacos que usa la estructura tridimensional del sitio activo de una enzima para predecir qué

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