BIOQUIMICA PRACTICA DE LABORATORIO # 4. ESTUDIO CINETICO DEL ENZIMA ALFA-AMILASA.

BIOQUIMICA

PRACTICA DE LABORATORIO # 4.

ESTUDIO CINETICO DEL ENZIMA ALFA-AMILASA.

INTRODUCCION.

La cinética enzimática tiene por objeto el estudio de la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas, así como los factores que en ella influyen y los mecanismos por los cuales transcurren.

La velocidad de las reacciones enzimáticas se puede medir:

- por la cantidad de sustrato que desaparece en la unidad de tiempo

- por la cantidad de producto que aparece en la unidad de tiempo

En esta práctica de laboratorio se comprobará la influencia de la concentración del sustrato (S), del enzima (E), el pH y la temperatura (T) en la cinética del enzima alfa-Amilasa salival en su acción sobre los enlaces alfa 1-4 del almidón. Para ello nos basaremos en la desaparición del almidón en la unidad de tiempo mediante el seguimiento de la reacción de color que produce el mismo, así como sus productos de hidrólisis con el Iodo en disolución de Ioduro de potasio (Reactivo de Lugol).

Dado que el almidón está integrado por dos fracciones, la amilosa y la amilopectina, debe tenerse en cuenta las reacciones que ambas producen (así como sus respectivos productos de hidrólisis) con el reactivo de Lugol:

AMILOSA AMILOPECTINA

Amilasa Salival

AMILODEXTRINAS

(+IODO Color azul violeta)

ERITRODEXTRINAS

(+IODO Color rojo pardo)

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MALTOSA + GLUCOSA DEXTRINAS LIMITES

(+IODO No dan coloración)

Basándonos en las reacciones anteriores podemos estudiar

Basándonos en las reacciones anteriores podemos estudiar el efecto que provocan en la cinética enzimática la variación de los factores que en ella influyen: c(S), c(E), pH y T, fundamentalmente. La influencia de la c(E) podremos estudiarla midiendo la velocidad de la reacción de la forma ya descrita pero utilizando diferentes c(E), manteniendo constante los demás factores. De forma similar se procede con el estudio de la influencia de la c(S). En el caso del estudio de la influencia del pH y la temperatura se ensayara la actividad del enzima a diferentes valores de ambos con la reacción del Lugol.

SUGERENCIA AL ESTUDIANTE:

Responda las siguientes preguntas (si es necesario consulte y busque en la bibliografía):

1.¿ Cuáles son las características estructurales del almidón?

2.¿ Qué tipo de enzima es la alfa-Amilasa salival?

3.¿ Cuáles son los productos que origina la acción de este enzima sobre el almidón?

4. Explique cómo influyen en la velocidad de las reacciones enzimáticas una variación en la concentración del enzima presente, en la concentración del sustrato, el pH y la temperatura.

BIBLIOGRAFIA.

Lehninger. Bioquímica. Págs. 270-272. y notas de clase.

REACTIVOS.

• Solución del enzima: Se prepara colectando 1 ml de saliva (previo enjuague de la boca con agua destilada) y diluyéndolo hasta 20 ml con agua destilada.

• Disolución de almidón al 0,5 %.

• Disolución de Lugol: Se prepara disolviendo 1 g de iodo, 2 g de KI en 200 ml de agua destilada.

• Disoluciones tampón de pH 5,0; 6,8 y 8,0.

• Tubos de ensayo, placa de porcelana con excavaduras, vasos de precipitado, baño de agua termostatado, cronómetro.

EXPERIMENTO # 1:

ESTUDIO DE LA INFLUENCIA DE c(E).

PROCEDIMIENTO:

1. Tome 4 tubos de ensayo y añada a cada uno 2 ml de disolución de almidón al 0,5 %.

2. Añada a cada tubo 0,1; 0,2; 0,3 y 0,4 ml de disolución del enzima respectivamente, y complete hasta un volumen de 0,5 ml con agua. Añada primero el agua y luego la disolución del enzima, pues de lo contrario la reacción comenzará a verificarse y usted no tendrá en cuenta el tiempo transcurrido. Inmediatamente después de adicionar la solución del enzima al último tubo ponga en marcha el cronómetro y comience a medir el tiempo del experimento.

3. En cada intervalo de 1 minuto ensaye en la placa con excavadura la reacción de la solución experimental con el Lugol: para ello sólo tiene que extraer con el gotero pequeñas cantidades de cada tubo de ensayo en reacción a una excavadura de la placa y luego adicionar una gota del reactivo de Lugol. Observe y anote el color para cada tiempo y cada tubo ensayados.

4. Determine por el procedimiento anterior el tiempo que tarda cada uno de los tubos en no dar reacción alguna con el reactivo de Lugol, la mezcla de las dos gotas debe quedarse del color original del Lugol. Si desea puede adicionar en una excavadura unas gotas de agua y Lugol para tenerlo como solución de control.

5. Con los datos obtenidos construya la siguiente tabla:

TUBOS 1 2 3 4

Volumen de enzima (ml)

Tiempo total de reacción (min)

Velocidad de la reacción

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