Espectrofotometria

Antecedentes

Antes de 1940 la mayoría de las determinaciones en química clínica eran del tipo volumétricas y gravimétricas. Por lo que la mayor parte de los resultados fueron semicuantitativos. En la década de 1950 se comienza a utilizar el espectrofotómetro (EE.UU.). Éste eliminó el comparador de color, logrando así que los análisis fuesen más cuantitativos, confiables, reproducibles e incrementando la precisión y la exactitud.

Un espectrofotómetro es un instrumento que tiene la capacidad de manejar un haz de Radiación Electromagnética (REM), comúnmente denominado Luz, separándolo en facilitar la identificación, calificación y cuantificación de su energía. Su eficiencia, resolución, sensibilidad y rango espectral, dependerán de las variables de diseño y de la selección de los componentes ópticos que lo conforman. El espectrofotómetro se usa en el laboratorio con el fin de determinar la concentración de una sustancia en una solución, permitiendo así la realización de análisis cuantitativos, también es utilizado en los laboratorios de química para la cuantificación de sustancias y microorganismos. El espectrofotómetro, construido mediante procesos avanzados de fabricación, es uno de los principales instrumentos diagnósticos y de investigación desarrollados por el ser humano. Utiliza las propiedades de la luz y su interacción con otras sustancias, para determinar la naturaleza de las mismas. En general, la luz de una lámpara de características especiales es guiada a través de un dispositivo que selecciona y separa luz de una determinada longitud de onda y la hace pasar por una muestra. La intensidad de la luz que sale de la muestra es captada y comparada con la intensidad de la luz que incidió en la muestra y a partir de esto se calcula la transmitancia de la muestra, que depende de factores como la concentración de la sustancia.

Se denomina espectrofotometría a la medición de la cantidad de energía radiante que absorbe un sistema químico en función de la longitud de onda de la radiación, y a las mediciones a una determinada longitud de onda. La espectrofotometría es uno de los métodos de análisis más usados, y se basa en la relación que existe entre la absorción de luz por parte de un compuesto y su concentración. Cuando se hace incidir luz monocromática (de una sola longitud de onda) sobre un medio homogéneo, una parte de la luz incidente es absorbida por el medio y otra transmitida, como consecuencia de la intensidad del rayo de luz sea atenuada desde Po a P, siendo Po la intensidad de la luz incidente y P la intensidad del rayo de luz transmitido. Dependiendo del compuesto y el tipo de absorción a medir, la muestra puede estar en fase líquida, sólida o gaseosa. En las regiones visibles y ultravioleta del espectro electromagnético, la muestra es generalmente disuelta para formar una solución.

Espectrofotómetro de Haz Sencillo

Los instrumentos de simple haz son aquellos en los cuales el haz de luz sigue una única trayectoria entre la fuente y el detector. La banda de luz atraviesa la muestra que se halla contenida en una celda, la luz transmitida por la muestra pasa al detector originándose una corriente eléctrica que por medio de diferentes circuitos permite observar una señal, ya sea el movimiento de una aguja o señal digital o un registro gráfico.

Los instrumentos de haz sencillo son adecuados para las mediciones cuantitativas de absorción a una sola longitud de onda. En este caso, las ventajas son la sencillez del instrumento, su bajo costo y la facilidad de mantenimiento. Algunos fabricantes de instrumentos ofrecen espectrofotómetros y fotómetros de haz sencillo de una sola longitud de onda.

Espectrofotómetro de Doble Haz

En los instrumentos de doble haz la luz proveniente de la fuente es dividida en dos haces después de salir del monocromador mediante un sistema de espejos divisores. Esta división produce dos haces de luz, uno de ellos se dirige a la celda de referencia, que contiene el blanco, y el otro haz se dirige hacia la celda de muestra. Los dos haces de luz después de atravesar la celda de referencia y la de muestra llegan a detectores separados para obtener la señal correspondiente.

Los sistemas de doble haz tienen la ventaja de que cualquier variación en la intensidad de la fuente, la eficiencia de la red, la reflectividad de los espejos, la fotosensibilidad del detector, etc., afecta simultáneamente a los dos haces. En consecuencia, la relación de energía de los dos haces permanece siempre constante.

Partes del espectrofotómetro y su funcionamiento

Las principales partes de un espectrofotómetro son tres, el sistema de iluminación, el sistema monocromador y un sistema de detección y registro.

• El sistema de iluminación

Los requerimientos para el sistema de iluminación dependen de la región espectral

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