Extracción De ADN Y Electroforesis En Muestra De Mucosa Bucal

Extracción de ADN y Electroforesis en muestra de mucosa bucal

Pilar Duarte, Estudiante de Pedagogía en Biología y Química

Universidad Iberoamericana de Ciencias y Tecnología, Dirección de Educación, Facultad de Ciencias Básicas, Laboratorio de Biología Molecular

Viernes 19 de Abril 2013

Introducción

La extracción de ADN Consiste en separar la molécula de ADN del resto de componentes celulares (1). El ADN se encuentra en el interior del núcleo celular, disperso y muy replegado, unido a proteínas para formar la cromatina (2). Para poder extraerlo, es necesario romper las células y separar el núcleo para después romper éste y liberar el ADN. Una vez liberado se debe separar de las proteínas y precipitarlo para su extracción (3). Un método rápido para obtener ADN y llevar a cabo la extracción, es obtener una muestra de la mucosa bucal presente en la cavidad bucal, la cual se extiende desde el borde rojo de los labios hasta el itsmo de las fauces (4). Esta se puede clasificar en: Mucosa masticatoria: es la que recibe directamente las cargas de masticación de alimentos. Los alimentos se deslizan por las zonas próximas a los dientes: encía y paladar duro. Mucosa de revestimiento: se encuentra en la cara interna del labio, cara interna de las mejillas, piso de la boca, cara inferior de la lengua y paladar blando. Estas zonas no participan, directamente, en el fenómeno masticatorio y no tienen receptores del gusto. Tiene receptores de tacto y de dolor (esta última es la que utilizaremos en nuestra extracción de ADN) (5).

Este método de extracción, me permitirá obtener ácidos nucleicos purificados de la mucosa bucal para después realizar un análisis de este ADN en una técnica rigurosa denominada electroforesis. La electroforesis me permite separar especies químicas (ácidos nucleicos o proteínas) a lo largo de un campo eléctrico en función de su tamaño y de su carga eléctrica (6). El ADN tiene por naturaleza carga negativa. Si ponemos fragmentos del ADN extraídos de nuestra muestra de mucosa bucal sobre un soporte poroso (gel) y aplicamos un campo eléctrico, se producirá la migración diferencial de los fragmentos a través de los poros de la matriz (7). La tinción del gel con bromuro de etidio, que es una sustancia fluorescente que se intercala en la molécula de ADN, y la exposición con luz ultravioleta, permite observar el resultado de ésta migración. El tamaño de los fragmentos de ADN se puede estimar comparándolos con el patrón de bandas que se obtiene de marcadores comerciales de peso molecular conocido. La electroforesis de ADN es útil para comparar patrones de bandas de diferentes muestras biológicas (8).

El objetivo de este práctico es realizar las técnicas de extracción de ADN y electroforesis a partir de muestras de la mucosa bucal para aplicar lo visto teóricamente en clases. Además de conocer los fundamentos de la electroforesis y de la extracción.

Materiales y Métodos

EXTRACCIÓN DE ADN

En un tubo de polipropileno de 1,5 mL, se adicionó 200 µL de una solución de Chelex – 100 5% y luego se rotulo el tubo. Se procedió a tomar una muestra de mucosa bucal utilizando una tórula estéril, y luego se resuspendió el contenido celular de la tórula en los 200 µL de Chelex- 100 5%, Luego se agitó el tubo por inversión durante 30 segundos y se procedió a incubar la muestra en un baño termorregulador a 56°C por 30 minutos. Una vez finalizada la incubación, se agitó el tubo en un vortex por 10 minutos y se volvió a incubar la muestra a baño maría, pero esta vez a 100°C por 8 minutos. Una vez incubada la muestra se agitó nuevamente por inversión, por 10 segundos y se centrifugó a 13.000 rpm durante 3 minutos en una microcentrífuga. Finalmente, con ayuda de una micropipeta se extrae el sobrenadante y se pasa a un nuevo tubo de 1,5 mL. El ADN extraído es guardado en un frízer hasta su posterior uso.

ELECTROFORESIS

Se procede a preparar el buffer de electroforesis, donde se utilizará 300 mL (como mínimo) de TBE (1X) como buffer de corrida. Luego se prepara el gel de agarosa al 1% (para un volumen de 30 mL). Se masa la agarosa, y se adiciona 30 mL de buffer TBE 1 x, se le agrega bromuro de etidio y se procede a calentar. Se prepara la cama del gel, el cual se cella con cinta adhesiva para evitar que este se salga por los bordes y quede una constitución

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