Microbiologia

Técnicas en microbiología.

Tema 1. Generalidades.

Medios de cultivo:

Componentes más comunes:

• Compuestos aminonitrogenados: peptonas, extractos, infusiones, etc...Los microorganismos no suelen tener enzimas extracelulares con las que hidrolizar las proteínas para obtener nitrógeno, por ello es necesario suministrar extractos ya hidrolizados.

Peptonas: hidrolizado proteico fuente de nitrógeno. Se obtiene de diferentes formas, por hidrólisis enzimatica o por hidrólisis ácida, las dos formas dan resultados distintos. Las peptonas no son útiles para pruebas de identificación o caracterización por que poseen restos de azucares que podrían dar falsos positivos.

• Extractos de carne, malta, levadura..: el de levadura es el mas usado porque tiene vitaminas factores de crecimiento vitaminas y es fuente de N.

• Factores de crecimiento: sangre, suero, vitaminas, NADH, metales traza, aminoácidos,.... Hay que tener cuidado por si fuesen termolábiles, ya q no se podrían esterilizar en autoclave. También se usan como agentes protectores contra ciertos microorganismos.

• Fuentes de energía: generalmente glucosa.

• Sales tamponadas: citratos, acetatos, fosfatos, etc...para estabilizar el pH del medio.

• Sales minerales y metales: sulfatos, fosfatos, Ca, Fe, Mn, Mg, metales traza. Suelen ser contaminantes de otros compuestos. Se añaden especialmente cuando queremos detectar determinada actividad.

• Componentes especiales, agentes selectivos: son reactivos químicos, antibióticos, colorantes, inhibidores... para hacer medios selectivos o para identificar algún microorganismo, etc...

• Indicadores colorimétricos: indican el cambio de pH del medio durante el crecimiento y al final.

• Agentes solidificantes: agar, gelatina, alginatos, solidifican el medio. El mas usado es el agar: 2% para levaduras, 1'5% para bacterias y hongos, y 1-0'75% para pruebas de movilidad de bacterias.

Clases de medios:

• Medios generales o comunes: medios que permiten el crecimiento de un amplio espectro de microorganismos.

• Medios enriquecidos: son similares a los generales pero se les añade algún factor de crecimiento o suplemento de algún tipo.

• Medios de enriquecimiento: son los que favorecen el crecimiento de un tipo de microorganismo frente al resto en una población mixta.

• Medios selectivos: permiten el crecimiento de ciertos microorganismos impidiendo que crezcan otros (TCBS para Vibrio).

• Medios diferenciales: se usan para identificar microorganismos.

• Medios mantenimiento y conservación: para conservar al microorganismo durante un gran periodo de tiempo.

o Congelación: a -80ºC. Los medios tiene concentraciones bajas de azucares y se suplementa con glicerol para evitar la formación de cristales de hielo. Se usan tubos eppendorff o criotubos.

o Las levaduras se conservan en agua a 4ºC en tubos con medio SLAM. Se añade parafina encima para producir anaerobiosis y proteger a las células.

o Liofilización: consiste en congelar y desecar la muestra.

Los medios los venden casi preparados, normalmente hay que disolverlos y esterilizarlos, si el medio lleva agar hay que hervirlo para que se disuelva y posteriormente autoclavarlo, esto cuando se distribuye en tubos.

Métodos de esterilización.

• Calor húmedo:

o Autoclave: 12ºC durante 15 minutos. El medio queda libre de microorganismos y esporas. No se puede usar con medios con elevadas concentraciones de azucares ya que estos caramelizan.

o Tindalización: tres ciclos de 100ºC que permiten el desarrollo de esporas entre dos ciclos sucesivos de modo que pueda acabar con ellas.

• Filtración: se usa con compuestos termolábiles. Las membranas de 0'22 micras son amicróbiocas, las de 0'45 permiten el paso de bacterias pero no de hongos ni levaduras.

• Calor seco: en cabinas y hornos a altas temperaturas. Son ciclos de 170ºC durante 90 minutos. Se usa para el vidrio.

• Agentes químicos: el material plástico de polietireno viene esterilizado por agentes químicos. Como el oxido de etileno liquido que no deja residuos.

• Radiaciones UVA y radiaciones gamma: las primeras esterilizan superficies las segundas se usan para medicamentos o productos que se vayan a envasar.

Tema 2.

Aislamiento y cultivo de muestras.

• Tipos de cultivo:

o Puro o axenico: procede de una sola célula.

o Mixto: por mas de una población.

o Bimembre: por un microorganismo que necesita, para vivir, el que nosotros estudiamos. Por ejemplo el cultivo de fagos necesita un césped bacteriano para desarrollarse.

• Los medios mas usados son:

o Para bacterias: TSA, TSB. Agar sangre y agar nutritivo.

o Para levaduras: YEPD, agar saboureau y agar malta.

o Para virus: céspedes celulares.

• Tipos de siembra:

o En placa por extensión:

o En placa por estrías:

o Por vertido en placa: se siembran 100microlitros de la muestra y sobre esta el medio de cultivo, después se autoclava. El crecimiento es dentro del medio.

o Replicador multipunto: permite siembra diferentes cepas en una misma placa. Se usa para pruebas de identificación.

o Por aislamiento en estría:

o En medio liquido.

• Los hongos se cultivan en cámaras húmedas.

Métodos de cuantificación.

• Cuantificación por cámara: puede ser una cámara Thoma o Neubauer. Una cámara Thoma esta dividida en 16 partes cada una dividida a su vez en 16 subunidades, en ella se meten 10-4 ml para el recuento. En una cámara de Neubauer también hay una primera

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