OBTENCION DE CELULAS DEL SISTEMA INMUNOLOGICO APARTIR DE ORGANOS LINFOIDES

OBTENCION DE CELULAS DEL SISTEMA INMUNOLOGICO APARTIR DE ORGANOS LINFOIDES

Las respuestas inmunitarias innata y adaptativa dependen de las actividades de los leucocitos. Estas células se originan en la médula ósea, y muchas también se desarrollan y maduran ahí. Después migran para proteger los tejidos periféricos, algunas de ellas residen dentro de los tejidos, otras circulan en el torrente sanguíneo y en un sistema de vasos especializado llamado sistema linfático, que drena líquido extracelular y células libres desde los tejidos, los transporta por el cuerpo como linfa, y finalmente se vacía de regreso hacia el sistema vascular sanguíneo.

Los linfocitos circulan en la sangre y la linfa, y se encuentran también en grandes números en tejidos linfoides u órganos linfoides, que son agregados organizados de linfocitos en una red de células no linfoides. Los órganos linfoides pueden dividirse a grandes rasgos en órganos linfoides centrales o primarios, donde se generan los linfocitos, y órganos linfoides periféricos o secundarios, donde se mantienen los linfocitos vírgenes maduros y se inician respuestas inmunitarias adaptativas.

Los órganos linfoides centrales son la médula ósea y el timo, un órgano que se encuentra en la parte alta del tórax. Los órganos linfoides periféricos comprenden los ganglios linfáticos, el bazo, y los tejidos linfoides de la mucosa del intestino, las vías nasales y respiratorias, las vías urogenitales, y otras mucosas. Los ganglios linfáticos están interconectados por medio de un sistema de vasos linfáticos, que drenan líquido extracelular desde los tejidos, a través de los ganglios linfáticos, y de regreso hacia la sangre.

III. PROCEDIMIENTO

A) OBTENCION DE CELULAS

MÉDULA ÓSEA

1. Matar la rata por dislocación cervical o inhalación de CO2. Colocar la rata sobre una tabla de disección con el vientre hacia arriba. Empapar la rata con etanol para reducir el transporte de pelos con el aire.

2. Hacer un corte transversal largo a través de la piel en la parte media del área abdominal. Retirar la piel de las patas traseras.

3. Separar las piernas del cuerpo al nivel de la articulación de la cadera. Retirar la grasa y colocar las piernas en una placa petri con medio.

4. Retirar el tejido muscular del fémur y la tibia. Separar el fémur y la tibia y cortar las epífisis en ambos extremos.

5. Inyectar por los extremos del hueso 3ml de medio o PBS, con una jeringa para expulsar la medula ósea

6. Remover los desechos grandes y los acúmulos celulares.

7. Lavar la suspensión por centrifugación a 300xg por 10 minutos a 4 grados y colocar en el medio al 5% de FS.

TIMO

1. Matar la rata por dislocación cervical o inhalación de CO2. Colocar la rata sobre una tabla de disección con el vientre hacia arriba. Empapar el abdomen la rata con etanol para reducir el transporte de pelos con el aire.

2. Usando la tijera, hacer una incisión desde la región xifoidea hasta la región submandibular y retirar la piel lateralmente.

3. Hacer una incisión en el tórax y separar los bordes de la incisión.

4. Usando el fórceps, cuidadosamente agarrar los lóbulos tímicos y levántelos.

5. Poner el timo en una placa petri con medio.

6. Cortar el timo en pequeños trozos y haga una suspensión.

7. Cuidadosamente triturar el tejido en el homogeneizador de vidrio, utilizando el embolo de una jeringa de 5 ml

8. Remover los desechos grandes y los acúmulos celulares.

9. Lavar la suspensión por centrifugación a 300xg por 10 minutos a 4 grados y colocar en el medio al 5% de FS.

BAZO

1. Matar la rata por dislocación cervical o inhalación de CO2. Colocar la rata sobre una tabla de disección con el vientre hacia arriba Empapar el abdomen la rata con etanol para reducir el transporte de pelos con el aire.

2. Hacer una incisión a través de la piel en la región inguinal. Con los dedos sobre ambos lados del corte, tire entre la cabeza y la cola hasta que la pared peritoneal este lo suficientemente expuesta. Empapar la cavidad peritoneal con etanol.

3. Cortar el peritoneo, levante el bazo con los fórceps, y separe este de los tejidos adyacentes con la tijera. Colocar el bazo en una placa petri con medio.

4. Cortar el bazo en pequeños trozos y haga una suspensión.

5. Cuidadosamente triturar el tejido en el homogeneizador de vidrio, utilizando el embolo de una jeringa de 5 ml.

6. Remover los desechos grandes y los acúmulos celulares.

7. Lavar la suspensión por centrifugación a 300xg por 10 minutos a 4 grados y colocar en el medio al 5% de FS.

B) CONTEO CELULAR

1. Diluir las células en la solución de Turk.

2. Mezclar completamente y añadir 1 gota en la cámara de Neubauer usando la pipeta Pasteur o micropipeta

3. Contar las células de los cuadrantes de los extremos (1,3,7 y 9). Incluya en este recuento las células que se observan sobre las líneas de dos lados de cada cuadrado revisado.

4. Conteo de células/ml=Numero de células (promedio correspondiente a un área de 1mm2) x factor de dilución x104.

C) DETERMINACIÓN DE LA VIABILIDAD CELULAR (Exclusión por azul de Trypan)

1. Mezclar 0.05 ml de la solución de azul de trypan, y 0.05 ml de la suspensión celular. Dejar incubar 5 minutos.

2. Transferir una pequeña cantidad de la suspensión a la cámara de Neubauer y contar las células. Las células no viables

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