Practica Cuantificación de Proteínas

Práctica 4. Cuantificación de Proteínas.

Resumen

Introducción.

Para el estudio de la estructura proteica, o el contenido proteico de los alimentos, es necesario hacer uso de métodos que nos permitan cuantificar la concentración de proteínas, para lo cual se han desarrollado diversas técnicas con sus pros y contras cada una de ellas. Existen diferentes métodos para la cuantificación de proteínas. Muchos de estos métodos se basan en: a) la propiedad intrínseca de las proteínas para absorber luz en el UV, b) para la formación de derivados químicos, o c) la capacidad que tienen las proteínas de unir ciertos colorantes.

Tipo de Método Nombre del Método

Métodos de absorción A280-260

A235-280

A215-225

Métodos

derivados

Colorimétricos Biuret

Lowry

Bradford

BCA

Métodos derivados

Fluorimétricos o-ftalaldehido

Tabla 1. Métodos más comunes para la cuantificación de proteínas

Método Ventajas Inconvenientes

Métodos

De

Absorción No se pierden las muestras Interfieren muchos compuestos que absorben luz UV

Métodos derivados Colorimétricos

Biuret Bastante específico para proteínas. Muestra pocas interferencias.

Es barato Tiene poca sensibilidad.

Lowry Tiene bastante sensibilidad No todas las proteínas reaccionan igual.

Muestra muchas interferencias como detergentes no iónicos, sulfato amónico, etc.

Bradford Muy sensible Muestra interferencia con detergente

BCA Es el método más sensible.

Es el que muestra menos interferencias

Tabla 2. Ventajas e inconvenientes de los principales métodos.

Método de Lowry: Es un método colorimétrico de valoración cuantitativa de proteínas, en donde a la muestra se le añade un reactivo que forma un complejo coloreado con las proteínas, siendo la intensidad de color de la disolución resultante proporcional a la concentración de proteínas, en donde los iones Cu2+, en medio alcalino, se unen a las proteínas formando complejos con los átomos de nitrógeno de los enlaces peptídicos. Estos complejos Cu2+-proteínas tienen un color azul claro. , provocan el desdoblamiento de la estructura tridimensional de la proteína, exponiéndose los residuos de tirosina que van a participar en la segunda etapa de la reacción. El Cu2+ se mantiene en solución alcalina en forma de su complejo con tartrato.

Espectrofotometría: Es el procedimiento para la determinación de las concentraciones de proteínas presentes en extractos de una determinada línea celular mediante la medición espectrofotométrica de azul brillante de coomasie en forma aniónica, es utilizado para la cuantificación de proteínas obtenidas en muestras pequeñas el máximo de absorbencia del colorante azul de coomasie en solución ácida varía de 495 a 595nm tras añadir proteína debido a la estabilización de la forma aniónica del mismo por interacciones hidrofóbicas e iónicas.

Método de Biuret: se basa en la formación de un complejo coloreado entre el Cu2+ y los grupos NH de los enlaces peptídicos en medio básico. 1Cu2+ se acompleja con 4 NH. La intensidad de coloración es directamente proporcional a la cantidad de proteínas (enlaces peptídicos) y la reacción es bastante específica, de manera que pocas sustancias interfieren. La sensibilidad del método es muy baja y sólo se recomienda para la cuantificación de proteínas en preparados muy concentrados (por ejemplo en suero). Este método permite determinar la concentración de proteínas de una muestra mediante espectroscopia ultravioleta-visible a una longitud de onda de 540 nm (para detectar el ión Cu2+)

El método de nuestro interés es un método derivado colorimétrico según la clasificación de la Tabla 1. El método de Bradfor que es relativamente barato y con sensibilidad muy alta; se basa en la unión de un colorante, Comassie Blue G-250 (también Serva Blue) a las proteínas. El colorante, en solución ácida se presenta en dos formas: azul y naranja las proteínas se unen a la forma azul

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