Preparación De Solución Stock

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INTRODUCCIÓN

Para la buena formación del estudiante la teoría y las prácticas son muy importantes para cada estudiante de cualquier escuela ya que permite desarrollar sus conocimientos y llegar a un verdadero resultado en cualquier campo de estudio, esto apoyándose en las revisiones bibliográficas respecto al tema para poder conocer con mayor exactitud y llegar al objetivo de la práctica.

Para poder preparar las soluciones stock se debe tener en cuenta las condiciones de asepsia para que no ingrese cualquier patógeno a las soluciones ya que eso perjudicaría en gran manera al cultivo que se va ha desarrollar

Los medios nutritivos para el cultivo de células y tejidos vegetales , se deben realizar de manera exacta porque todo ese conjunto de condiciones son los que controlan el crecimiento.

I. OBJETIVOS

a. General:

Preparar las soluciones stock

b. Específico:

• Preparar los equipos y materiales.

• Determinar las dosis de cada sal

• Realizar la homogenización adecuada en las soluciones.

II. MARCO TEÓRICO

Medios de cultivo

Los medios de cultivo son una mezcla de nutrientes que, en concentraciones adecuadas y en condiciones físicas óptimas, permiten el crecimiento de los microorganismos, estos medios son esenciales en el laboratorio por lo que un control en su fabricación, preparación, conservación y uso, asegurar la exactitud, confiabilidad y reproducibilidad de los resultados obtenidos. En los laboratorios se utilizan diferentes tipos de medios de cultivo que pueden ser preparados en forma líquida o en forma sólida. Usualmente para preparar un medio sólido, se parte de un medio líquido al que se le añade un agente solidificante como el agar, la gelatina o la sílicagel. Una vez que ha sido preparado, un medio de cultivo puede ser inoculado (es decir, se le añaden organismos) y a continuación incubado en condiciones que favorezcan el crecimiento. El crecimiento de los microorganismos es el cultivo. Un cultivo axénico o puro contiene un único tipo de microorganismos. Los medios de cultivo deben contener los nutrientes y factores de crecimiento necesarios y deben estar exentos de cualquier microorganismo contaminante. Los medios de cultivo contienen como mínimo: carbono, nitrógeno, azufre, fósforo y sales inorgánicas. En muchos casos serán necesarias ciertas vitaminas y otras sustancias inductoras del crecimiento. También se añaden colorantes que actúan como indicadores. El agar es el principal agente solidificante utilizado en medios. Se disuelve completamente a 100°C y se solidifica al enfriarse a 40°C. (Clavell, 1992).

CLASIFICACION DE MEDIOS DE CULTIVO

De acuerdo a su consistencia, los medios de cultivo pueden clasificarse en:

 Líquidos: Se utilizan para el crecimiento de cultivos puros en lote. Se denominan caldos de cultivo y no tienen agar en su formulación.

 Semisólidos: Contienen 0.5% de agar en su formulación.

 Sólidos: Contienen de 1.5 a 2% de agar en su formulación.

 De acuerdo a su composición, los medios de cultivo pueden clasificarse en:

 Definidos: es aquél medio de cultivo del cual se conoce su composición exacta. Son muy utilizados en estudios fisiológicos. Los medios mínimos son medios definidos que únicamente le proporcionan al microorganismo los nutrientes necesarios para crecer, pero no para desarrollarse óptimamente.

 Complejos: es aquél del cual no se conoce la composición exacta del medio. A menudo, los medios complejos emplean sangre, leche, extracto de levaduras, extracto de carne u otras sustancias muy nutritivas pero de las cuales se desconoce la composición química exacta. Estos medios son muy utilizados para cultivar bacterias desconocidas o bacterias de requerimientos nutricionales muy complejos.

 Los medios de cultivo se pueden clasificar de acuerdo a la naturaleza de sus constituyentes en:

 Medios naturales o complejos: constituidos por sustancias complejas de origen animal o vegetal, las que son usualmente complementadas por la adición de minerales y otras sustancias. en ellos no se conocen todos los componentes, ni las cantidades exactas presentes de cada uno de ellos.

 Medios definidos o sintéticos: son los medios que tienen una composición química definida cualitativamente y cuantitativamente. Generalmente se usan en trabajos de investigación.

 De acuerdo al uso del medio de cultivo, éstos se clasifican en:

 Medios de enriquecimiento: son medios líquidos que favorecen el crecimiento de un tipo de microorganismo en particular. Permiten aumentar el número de microorganismos de ese tipo. Usualmente contienen una o más sustancias inhibidoras del crecimiento de los microorganismos con excepción de los que se quieren cultivar.

 Medios selectivos: son parecidos a los de enriquecimiento, se diferencian por ser medios sólidos y están diseñados para el aislamiento de microorganismos específicos.

 Medios diferenciales: son medios que contienen indicadores de productos derivados de la actividad microbiana de los microorganismos. no contienen ningún tipo de sustancia con actividad antimicrobiana, permiten revelar características fisiológicas de los microorganismos.

Los medios de cultivo se pueden preparar en el laboratorio a partir de cada uno de sus constituyentes básicos, o por simple rehidratación de productos asequibles comercialmente (medios de cultivo deshidratados), generalmente se prefiere el uso de los medios de cultivo deshidratados porque, además de simplificar el trabajo, con ellos se tiene mayor probabilidad de obtener resultados reproducibles.(Gutiérrez, 2001).

ASPECTOS PARA PREPARAR DE MEDIOS DE CULTIVO

 prepararlos sólo a partir de productos que provengan de fabricantes o proveedores que suministren productos de calidad.

 utilizar agua destilada o desmineralizada con una calidad microbiológica y fisicoquímica adecuada.

 utilizar materiales de vidrio bien lavados y enjuagados con agua destilada o desmineralizada.

 controlar el tiempo y la temperatura recomendada durante su esterilización. Nunca se deben exceder las condiciones señaladas por el fabricante.(Gutiérrez, 2001)

Los medios de cultivo se componen de:

• •Una fuente de carbono

• •Nutrientes minerales

• •Sustancias vitamínicas

• •Sustancias reguladoras del crecimiento

• •Agente gelificante (en el caso de medios

semisólidos)

• •Otros compuestos

Fuente de carbono: Prácticamente todos los cultivos son heterótrofos (comparativamente

unos pocos son autótrofos) y por ende necesitan del suministro de una fuente de carbono. La sacarosa, en concentraciones de 2 al 5%, es el azúcar más utilizado. En algunos medios se la reemplaza por glucosa. En casos particulares se cita el empleo de maltosa o galactosa. También myo-inositol (100 Mg/L) suele ser incorporado a los medios resultando un mejor crecimiento de los cultivos.

Nutrientes minerales: Los medios de cultivo deben suministrar los macro y micronutrientes esenciales para el crecimiento de las plantas enteras. En general se destacan las concentraciones relativamente altas de nitrógeno y potasio. El nitrógeno es suministrado en forma de amonio y/o nitrato. También se pueden utilizar urea, glutamina y caseína hidrolizada. Es fundamental que el hierro sea incorporado conjuntamente con un agente quelante (Na2EDTA), lo que lo hace disponible en un amplio rango de pH.

Sustancias vitamínicas: De todas las que comúnmente se incorporan a los medios, pareciera que la tiamina es la única realmente imprescindible para el buen crecimiento de los cultivos.

Sustancias reguladoras del crecimiento:

En la mayoría de los casos los medios utilizados para el establecimiento de los cultivos contienen auxinas (ANA, 2,4-D, AIA, IBA, NOA, Dicamba, Picloram) y/o citocininas ( BA, CIN, ZEA, 2iP, Thidiazurón). Las giberelinas (especialmente GA3) son requeridas en algunas ocasiones para el cultivo de meristemos o para la elongación de brotes. El ABA, es usado en algunos casos.

Agente gelificante (en el caso de medios semisólidos): El agar (entre 0,6 y 1%) es el compuesto más utilizado. También pueden emplearse «Agargel» (0,40-0,60%), «Transfergel» (2-2,60%), «Phytagel» (0,25- 0,40%), agarosa (0,80-0.90%) y «Gelrite» (0,10-0,20%).

Otros compuestos: Muchas sustancias, de variada composición química, suelen ser

adicionadas a los medios básicos. Además de la glicina, otros aminoácidos se pueden agregar a los medios. Es el caso de L-tirosina, asparagina y cisteína, aunque hay que tener presente que en dosis altas pueden inhibir el crecimiento de los cultivos. El carbón activado (0,1 a 5%) suele ser incorporado al medio, dado que es probable que absorba

Metabolitos tóxicos para los cultivos.

III. MATERIALES Y METODOS

A. MATERIALES

Materiales de limpieza

 Trapeador

 Balde

 Escoba

 Papel toalla

 Escobilla para tubo de ensayo

Materiales de laboratorio

 Probeta

 Pipeta

 Vaso de precipitación

 Matraz

 Balanza analítica

 Papel de filtro

 Papel de aluminio

 Placa de Petri

 Luna

 espátula

 pinzas

 autoclave

 Refrigeradora

 Guardapolvo

 Guantes

 Mascarilla

 gorra

B. INSUMOS

• Alcohol 96ª

• Agua destilada

• Lejía (hipoclorito de sodio 5 %)

• Detergente

Sales para la solución A

1. Nitrato de amonio (NH4NO3)

2. Nitrato de potasio (KNO)

3. Cloruro de calcio dihidratado(CaCl. 2H2 O)

4. Fosfato de potasio (KH2PO4)

5. Acido borico (H2BO3)

6. Sulfato de manganeso monohidratado(MnSO4 . H2O)

7. Sulfato de zinc heptahidratado(ZnSO4 . 7H2O)

8. Yoduro de potasio (KI)

9. Molibdato de sodio dihidratado(Na2MoO . 2H2O)

10. Sulfato de cobre pentahidratado(CuSO4 . 5H2O)

11. Cloruro de cobalto hexahidratado(COCl2 . 6H2O)

Sales para la solución B

Sulfato de magnesio heptahidratado(MgSO4 . 7H2O)

Sales para la solución C

NaEDTA dihidratado(Na.2H2O)

Sulfato ferroso heptahidratado(FeSO4 . 7H2O)

Componente para la solución D

Mio inositol (C6H6O6)

Componentes para la solución D

Ti-amina

Glicina

Ácido nicotínico

Piridoxina

C. METODOS

• Experimental

• Evaluación cuantitativa

• Operativo

IV. GENERALIDADES

a. UBICACIÓN

• Lugar: Laboratorio de cultivo de la FCAS- Satipo.

• Altitud: 633 m.s.n.m

• Latitud: 11º 12 56” S

• Longitud: 77 39 17” N

• Temperatura: 27 – 29 aprox.

• Clima: Tropical Húmedo

V. PROCEDIMIENTO DE LA PREPARACIÓN DE LA SOLUCIÒN STOCK

a. Diagrama de flujo

b. Detalle del procedimiento:

PROCEDIMIENTOS

Limpieza y desinfección del ambiente

1. Se procedió a la limpieza del ambiente y desinfección con lejía (hipoclorito de sodio 5%) de los ambientes, la sala de asepsia, sala de micropropagacion y sala de crecimiento.

2. Se lavó los materiales con agua y detergente y se enjuago 3 veces con agua destilada. destilada, posteriormente se colocaron sobre una base de papel toalla para su secado.

Esterilización de materiales

Los materiales se colocaron con mucho cuidado en el autoclave para ser esterilizados a una temperatura de 220°y una presión de 120 KPa por un tiempo de dos horas para eliminar todo tipo de agente patógeno que pueda alterar el proceso de cultivo.

Preparación del medio stock

SOLUCION A/100ml

Se peso exacto las siguientes sales y se agito durante todo el proceso de pesado de las sales:

 Nitrato de amonio (17.5gr)

 Nitrato de potasio (20gr)

 Cloruro de calcio dihidratado (5.15g)

 Fosfato de potasio (1.75gr)

 Acido borico (0.05gr)

 Sulfato de manganeso monohidratado (0.2gr)

 Sulfato de zinc heptahidratado (0.1gr)

 Yoduro de potasio (0.01gr)

 Molibdato de sodio dihidratado (0.002gr)

En 20ml se diluyo estas sales para extraer 1ml para agregar a la

solución A

 Sulfato de cobre pentahidratado (0.005gr)

 Cloruro de cobalto hexahidratado (0.005gr)

Culminada la solución A se hizo la mescla homogénea agitando para luego tapar el matraz de con papel aluminio y guardarlo

3. Siguiendo con el proceso de pesado de las sales se preparó la solución B/50ml, haciendo calentar el agua a 79°C para luego diluir la sal terminada la disolución se tapó con papel aluminio el matraz :

 Sulfato de magnesio heptahidratado (1.85gr)

4. en la solución C de igual forma se hizo calentar 20ml de agua a 79°c y se diluyo las siguientes sales una ves diluido las sales se procedió a cubrir todo el matraz con papel aluminio y se guardó a una temperatura de 4º C:

 naDTA dihidratado (0.75gr)

 sulfato ferroso heptadihidratado (0.55gr)

5. en 100ml de agua se diluyo:

 mio inositol (.0.1gr)

Solución E:

Se diluyeron en 100ml las siguientes sales:

Ti-amina (0.004gr)

Glicina (0.02gr)

Acido nicotínico (0.005gr)

Piridoxina (0.005gr)

Por cada pesada de la sal en la luna de cristal se procedía a desinfectar para evitar alteraciones en el peso y agentes contaminantes.

RESULTADOS

En la preparación de la solución A la solución se diluyo constantemente para evitar precipitaciones, el sulfato de cobre pentahidratado y cloruro de calcio se diluyo en frascos separados, la solución final de sales torno una coloración blanquecina pero al cabo de ser filtradas mostraron ser incoloras y transparentes.

Las soluciones D y E no mostraron cambio aparente, se guardaron separadamente en frascos matraz cubriéndoles la boca con papel aluminio.

CONCLUSIONES

La finalidad de la práctica es la preparación de las soluciones stock.se realizo todo los procedimientos teniendo en cuenta cada propiedad física - química de cada insumo. En contraste podemos afirmar que los alumnos aprendimos a preparar las soluciones stock.

En la preparación de equipos y material, en todo momento se mantuvo las condiciones de asepsia.

Las dosis de cada insumo (sales y compuestos organicos) se cuantificaron en miligramos, para tener en cuenta su exactitud se empleó la balanza analítica.

Para mantener la homogenización y evitar precipitaciones se debe mantener en constante remoción las soluciones.

BIBLIOGRAFIA

 Clavell, L.; Pedrique de Aulacio, M. 1992. Microbiología. Manual de Métodos Generales (2da edición). Facultad de Farmacia. Universidad Central de Venezuela

 Sofía Gutiérrez de Gamboa, Octubre 2001. http://www.ucv.ve/fileadmin/user_upload/facultad_farmacia/catedraMicro/10_Preparaci%C3%B3n_de_medios_de_cultivo.pdf.

 http://exa.unne.edu.ar/biologia/fisiologia.vegetal/CultivoTejidos.pdf

 ROCA, W.M. y L.A. MROGINSKI. 1993 (segunda edición). Cultivo de tejidos en la Agricultura: Fundamentos y aplicaciones. CIAT. Cali, Colombia, 970 pág.