Tincion De Gram

TINCIÓN DIFERENCIAL DE GRAM

INTRODUCCIÓN:

La tinción diferencial requiere más de un tipo de colorante y se utiliza para

distinguir entre varios tipos de células bacterianas. Una tinción diferencial típicamente

consiste de tres pasos principales: primero un colorante primario, el cual se utiliza para

teñir a todas las células en la tinción; enseguida un paso de decoloración, el cual remueve el

colorante solo de ciertos tipos de células y finalmente un colorante de contraste, el cual tiñe

las células recién decoloradas pero no tiene efecto sobre las células que aún retienen el

colorante primario.

La tinción propuesta por el médico danés Christian Gram en 1884, es una de las

tinciones diferenciales más utilizadas en bacteriología, que clasifica los cultivos bacterianos

de menos de 24 horas en Gram positivas y Gram negativas. La reacción de la tinción de

Gram se basa en la cantidad de peptidoglucano que se encuentra en las paredes celulares de

estas bacterias. Las bacterias Gram positivas tienen muchas capas de peptidoglucano, las

cuales a su vez, sostienen moléculas de ácido teicoico. El ácido teicoico reacciona con el

cristal violeta y el yodo utilizado en este proceso de tinción. Un complejo de las moléculas

cristal violeta-yodo-ácido teicoico es muy difícil de remover. Como la pared celular de las

células Gram positivas retiene estos compuestos, es más difícil decolorar una célula Gram

positiva que una Gram negativa. Una mezcla de alcohol remueve el cristal violeta de la

célula Gram negativa, pero no de la Gram positiva. Esta mezcla de alcohol también

disuelve mucho de la capa exterior de lipopolosacárido de la pared celular de la pared Gram

negativa, lo cual acelera la remoción del colorante primario cristal violeta de estas células.

Cuando otro colorante, usualmente safranina, se añade, las células Gram positivas

siguen de color azul-violeta mientras que las Gram negativas absorben el color rojizo de la

safranina. Al final del procedimiento de tinción, las células Gram positivas serán del color

del cristal violeta, o colorante primario, y las células Gram negativas serán del color de la

safranina que es el colorante de contraste.

OBJETIVOS:

1. Clasificar algunas especies bacterianas en Gram positivas o Gram negativas

de acuerdo a la tinción de Gram.

2. Comprender la importancia que tienen estas tinciones para la caracterización

e identificación de las bacterias.

Hans Christian Gram

(1853-1938)

MATERIAL POR EQUIPO:

- Microscopio óptico ☻

- Colorantes para tinción de Gram

- 1 mechero ☻

- asa microbiológica

- Pizeta ☻

- Recipiente de plástico para las tinciones

- Aceite de inmersión☻

- Papel seda ☻

- Plumón indeleble

- Cultivos bacterianos

(El material en letras cursivas será proporcionado por el profesor. Pedir el material marcado con ☻)

PROCEDIMIENTO:

1. Marcar un portaobjetos con el nombre del microorganismo a observar. Cada equipo

deberá hacer obligatoriamente cinco preparaciones (una preparación por persona):

una de E. coli, una de Bacillus sp., una de Serratia marcescens, una de Klebsiella

pneumoniae y alguna de Pseudomonas.

2. Elaborar preparaciones fijas de las bacterias a observar.

3. Añadir 1 ó 2 gotas de cristal violeta a la preparación, hasta que se cubra por

completo. Dejar actuar el colorante durante 1 minuto.

4. Una vez transcurrido el tiempo, lavar la preparación con la pízeta sobre el recipiente

de plástico para tinciones.

5. Agregar 1 ó 2 gotas de solución lugol a la preparación, y dejar actuar 1 minuto.

Transcurrido el tiempo, lava.

6. Con cuidado, añadir gota a gota el alcohol-acetona lavando la preparación durante

10 segundos.

7. Añadir el colorante de contraste, safranina (1 ó 2 gotas) y dejar actuar durante 30

segundos. Lava con la pizeta.

8. Dejar secar al aire y observar al microscopio, siguiendo la técnica de la práctica

anterior para enfocar correctamente. Observar con el objetivo de inmersión.

RESULTADOS: describe brevemente los resultados obtenidos.

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