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Producción De Vinagre Por Acetobacter

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Categoría: Ciencia

Enviado por: poland6525 05 junio 2011

Palabras: 3666 | Páginas: 15

...

tos que acompañan la bebida fermentada de la que se parte para la producción del mismo.

Hay tres métodos de producción industrial del vinagre:

* Método Orleans: En este método se llena la cuarta parte de una barrica con vinagre fresco elaborado recientemente que proporciona el inóculo de Acetobacter y Gluconobacter y, a continuación, se añade la bebida fermentada de la que se desea preparar vinagre. La barrica se deja abierta para que pueda producirse un intercambio de oxígeno suficiente. El proceso dura varias semanas y la eficiencia depende de la disponibilidad de oxígeno.

* Método de goteo: En este método se permite el contacto de las bacterias con el alcohol haciendo circular éste por una cámara de madera rellena con viruta de madera laxamente empaquetada. El proceso se desarrolla en continuo y el aparato se conoce como generador de vinagre. La aireación se consigue mediante la entrada de aire por la parte inferior del generador. La vida útil de un generador de vinagre puede ser muy larga. El producto final carece de bacterias porque éstas quedan fijadas al lecho de virutas.

Método de burbujeo: Se trata de un proceso de fermentación sumergida en el que el oxígeno se suministra mediante un proceso de burbujeo de aire. La velocidad de adición del alcohol se regula de manera que se permite una conversión muy eficiente del alcohol al ácido (llega a 98%). Este proceso presenta la desventaja frente al anterior de que es necesario filtrar el vinagre para eliminar las bacterias.

La importancia industrial de estas bacterias llega a niveles que no pueden pasar desapercibidos, por lo antes mencionado y por las pérdidas que puede representar una infección masiva con alguna estas bacterias en materia de alimentación y producción del vino. Es por ello que existe el interés de cultivar, identificar y caracterizarlas. A parte de esto nos mueve también el deseo de realizar procesos que contribuyan de manera significativa con nuestro aprendizaje, ya que este género bacteriano es de nivel industrial lo que nos llevaría a una práctica de lo que se hace en el mercado actual.

ANTECEDENTES

Las bacterias del genero Acetobacter son bacterias acéticas. Este tipo de bacterias se caracterizan por ser bacilos Gram negativos móviles, catalasa-positivos. Además, su metabolismo es estrictamente aerobio, con capacidad para crecer en medio ácido y de oxidar una gran cantidad de sustratos. Se caracterizan por su habilidad de convertir el alcohol (etanol) en ácido acético en presencia de aire. Hay muchas especies en este género y también otras bacterias son capaces de formar ácido acético bajo varias condiciones; pero todas las Acetobacter son reconocidas por esta habilidad.

Acetobacter es de particular importancia comercialmente, debido:

* son usadas en la producción de vinagre (intencionalmente convirtiendo el etanol del vino en ácido acético)

* pueden destruir vino al infectarse para producir excesivas cantidades de acético o acetato etílico, haciéndolo desagradable al paladar.

El crecimiento de Acetobacter en el vino puede suprimirse mediante una efectiva desinfección, almacenando el vino con exclusión completa de aire o echando una cantidad moderada de dióxido de azufre en el vino, a modo de preservativo.

Las Acetobacter pueden distinguirse en el laboratorio por el crecimiento de colonias en un medio que contiene 7 % etanol y suficiente carbonato de calcio para hacer que el medio sea parcialmente opaco. Cuando las colonias de Acetobacter transforman suficiente etanol a ácido acético, el carbonato cálcico (CO3Ca) alrededor de las colonias se disuelve, formando una zona clara muy apreciable.

Las primeras clasificaciones se hicieron atendiendo sólo a criterios morfológicos.

Hacia el año 1925 Vissert Hooft considera también su fisiología y ya en 1968 Asia usa, para su clasificación, la capacidad de estas para metabolizar glucosa y ácido acético.

Fue Frateur en el 1950 el que propuso un primer sistema de clasificación del género Acetobacter en 4 grupos: peroxydans, mesoxydans, oxydans, suboxydans. Estos nombres hacen referencia a un grado de capacidad de oxidar el etanol a ácido acético. Para ello, se basa en cuestiones bioquímicas como producción de catalasa, oxidación de acetato y la formación de compuestos cetónicos, pero sobre todo la capacidad para crecer en un medio con alcohol y sales de amonio como única fuente de nitrógeno, más conocido en microbiología como medio Hoyer.

Esta clasificación fue aceptada durante largo tiempo, así como que tales bacterias fueran móviles, tenían flagelos polares monótricos.

Ocurre un hecho curioso hacia el año 1964; Leifson descubre que algunas de estas cepas no presentan este tipo de flagelos. Para ello realiza sucesivos estudios aíslando algo más de 30 cepas diferentes que no mostraban este tipo de flagelos sino otros bien diferenciados poniendo de manifiesto otra forma flagelación, la peritica. Es entonces cuando él mismo propone separar, de forma muy acertada, el ACETOBACTER en dos géneros: acetobacter y acetomonas. En este último incluye las especies con flagelos polares multitricos, y las no flageladas, que por otra parte eran incapaces de oxidar el acetato y el lactato a CO2 y agua. Lo mismo aplica a las del genero acetobacter, pero estas aparte de poseer flagelos peritricos y también no flageladas si eran capaces de oxidar acetato y lactato a CO2 y agua.

Existe otra clasificación de mediados de los años 70 que dice que las bacterias acéticas pertenecen al orden Pseudomonodales, familia pseudomonodaceae envolviendo en esta última dos distintos al género Pseudomonas el género GLUCONOBACTER y el ACETOBACTER que incluye a su vez tres especies importantes: acetobacter aceti, acetobacter pasteurianus, y acetobacter peroxydans.

Los caracteres taxonómicos más importantes de cada una de ellos son los siguientes:

G. Pseudomonas

Flagelación polar

No desarrolla a pH 4,5

No oxida el etanol a acido acético

G. acetobacter

Flagelación peritrica

Desarrollo bueno a pH 4,5

Oxidación intensa etanol a ac. acético

G. gluconobacter

Flagelación polar

Desarrollo positivo a pH 4,5

oxidación moderada etanol a ácido acético

CON RESPECTO A LA MUTABILIDAD

Se pone de manifiesto la tendencia de las especies de acetobacter a dar cepas mutantes en generaciones siguientes, las cuales resultan muy diferentes a las ya existentes, esto se descubre basándose en trabajos y publicaciones de diversos autores como por ejemplo los puestos por Shinwel y Carr.

Ellos describen una mutación de Acetobacter en una cepa que se le denominó quasi acetobacter (o sea casi acetobacter), esto debido a la pérdida de la capacidad de oxidar el etanol a acético, en esta los demás caracteres no cambiaron.

Resulta muy difícil, sino, imposible clasificar todas las especies de acetobacter por la enorme facilidad que tienen los cultivos de mutar de forma espontanea. Esto nos lleva a la conclusión de que este tipo de bacterias no son genéticamente estables. La pronta perdida de alguno de los caracteres que las identifica son postulados que no se quedan al margen de polémicas, ya que en 1962 De Ley afirma que este tipo de cambios en el aspecto de las colonias obedece a factores de perdidas por caminos enzimáticos sin implicar variaciones bioquímicas. Es por esto que el propio De Ley supone, como hipótesis, la existencia de un biotipo ancestral de fuerte riqueza enzimática para la A. aceti y otro para la gluconobacter G. oxydans, donde las diferentes especies (termino este muy relativo) se originarían por perdida de uno o pocas enzimas.

CARACTERÍSTICAS

La familia Acetobacteraceae pertenece a la subclase a-Proteobacteria. Son bacterias aeróbicas, Gram negativas o gram variables que se caracterizan fenotípicamente por su capacidad de oxidar etanol a ácido acético en medios de cultivo con pH neutro o ácido. Genotípicamente la familia Acetobacteraceae puede ser distinguida de otras a-Proteobacteria por la presencia de dos sitios de restricción SphI y NcoI internos en la secuencia del gen 16S ADN-ribosomal, excepto en Gluconobacter oxydans en el que falta uno de los sitios NcoI, correspondiente al nucleótido 110 de G. diazotrophicus. Por lo tanto, cuando el ADN de un miembro de esta familia es digerido con la enzima de restricción SphI y se hibrida con una sonda de los genes 16S ADN-ribosomal, se detecta una banda de hibridación de 1.3 kb y cuando la restricción se hace con la enzima NcoI se encuentra una banda de 1.24 kb.

Viven en la superficie de las plantas donde constituyen una microflora secundaria que utiliza los productos de desecho de la microflora primaria (bacterias lácticas y levaduras). Esto es así porque presentan la capacidad de utilizar alcoholes como fuente de carbono y energía produciendo su oxidación a ácido (bacterias suboxidantes como Gluconobacter) o a CO2 y H2O (bacterias superoxidantes como Acetobacter). La producción de ácido acético por estas bacterias las hace extremadamente acidófilas.

Las bacterias suboxidantes carecen de un ciclo de los ácidos tricarboxílicos completo por lo que oxidan de forma estequiométrica el etanol a acético. Las bacterias superoxidantes realizan una primera oxidación a acético; pero la presencia de ciclo de ácidos tricarboxílicos permite la oxidación total mucho más lenta. Otra particularidad del grupo es que la utilización de azúcares se produce únicamente por la ruta de las pentosas.

Además de por su diferente capacidad de oxidación de alcoholes las dos bacterias del ácido acético pueden diferenciarse por su flagelación polar en Gluconobacter y peritrica en Acetobacter, como ya lo mencionamos.

Ciertos grupos de Acetobacter son capaces de producir una gran cantidad de celulosa extracelular que llega a formar verdaderas películas de este polímero.

Aplicaciones industriales

Tienen muchas aplicaciones industriales como la producción de vinagre, Ácido glucónico, sorbosa, celulosa, etc.

Taxonomía de las bacterias acéticas |

Reordenación por pruebas moleculares (año 2003) 6 Géneros y 34 especies: |

|

Acetobacter (14 especies) |

Gluconobacter (3 especies) |

Gluconoacetobacter (11 especies) |

Acidomonas (1 especie) |

Asaia (4 especies) |

Kozakia (1 especie) |

Las bacterias del género Acetobacter se utilizan en la producción de compuestos orgánicos como:

* Sorbosa: Para la fabricación de ácido ascórbico

* Sorbosa ----(acetobacter)------>Sorbitol---->----> Vitamina C

* Dihidroxiacetona:

* Bronceador: Glicerol----(acetobacter)------>Dihidroxiacetona

A continuación algunas especies de las bacterias que forman parte de este género:

* A. aceti

* A. pasteurianus

* A. hansenii

* A. liquefaciens

* A. xylinum

Estas bacterias son útiles para el tratamiento de dismicrobismos gastroenterales, infecciones gastroenterales agudas y crónicas y deterioros de la funcionalidad gastroenteral, en particular Acetobacter xylinum. En la actualidad, existen composiciones farmacéuticas y alimentarias que contienen microorganismos del género Acetobacter xylinum como ingrediente activo, en mezcla con vehículos. Las composiciones son aptas para administración oral o rectal y se administran en forma de cápsulas, sachets, suspensiones, supositorios o enemas. Como ejemplos de las composiciones alimentarias se pueden mencionar jugos, gelatina, extracto de fruta o mousse.

Acetobacter xylinum tiene la capacidad de sintetizar celulosa a partir de una gran variedad de sustratos y es una de las más importantes bacterias productoras de celulosa, ya que la produce en una cantidad suficiente para interés industrial. La celulosa producida por Acetobacter xylinum es químicamente pura, libre de lignina y hemicelulosa. Además es un polímero altamente cristalino con un elevado grado de polimerización, lo que la distingue de otras formas de celulosa.

Durante la mayor parte de la historia, el ácido acético, en la forma de vinagre, ha sido preparado por bacterias del género Acetobacter. Algunos insumos comunes son la sidra, el vino, cereal fermentado, malta, arroz, o patatas; todos alimentos alcohólicos. Acetobacter aceti es utilizada en la elaboración de vinagre a partir de estos alcoholes.

Una solución diluida de alcohol, inoculada con Acetobacter y mantenida en un lugar cálido y aireado se hará vinagre en el transcurso de algunos meses. Los métodos industriales de preparación de vinagre aceleran este proceso al mejorar el suministro de oxígeno a las bacterias. A veces la mezcla con otras bacterias del mismo género permite la creación de un producto de forma más eficiente que al utilizar un solo tipo de microorganismo. La mezcla puede incluir A. hansenii, A. rancens, A. oxydans, entre otras.

Metodología

Protocolo

Materiales y Muestras

* Muestras de suelo en sembradíos de uvas.

* Sidra de Manzana.

* Manzanas podridas.

* Uvas podridas y contaminadas por drosophila melanogaster meigen.

* Vino al aire libre.

Medios de cultivo:

Medio de Hoyer

* 1.0 g (NH4)2SO4

* 0.9 g KH2PO4

* 0.25 g MgSO4*7H2O

* 0.1 g K2HPO4

* 0.02 g FeCl3*6H2O

* 200.0 mL de una solución de etanol. Añada 56 ml de etanol al agua destilada y lleve el volumen a 200.0 mL. Homogenice. Esterilice con filtro.

Añada todos los componentes, excepto la solución de etanol, al agua destilada y consiga un volumen de 800.0 mL. Homogenice. Agregue volúmenes de 4 mL en los tubos de ensayo. Coloquelos en el autoclave por 15 minutos a una 15 presión de psi. Deje enfriar a 25º C. Agréguele asépticamente 1.0 mL de la solución de etanol a cada tubo. Homogenice.

YGC Medio

* 20.0 g Agar

* 20.0 g Glucosa

* 20.0 g CaCO3

* 10.0 g extracto de Levadura

Añada todos los ingredientes al agua destilada y lleve el volumen a 1.0 L. Homogenice. Calentar suavemente y llevar a ebullición. Autoclave a 30 minutos y 10 psi de presión. Deje enfriar hasta 48º C. Homogenice. Coloque en platos estériles Petri.

Procedimiento

1. Inocule las muestras en dos tubos del medio de Hoyer y dos placas de medio YGC. Incube a 30º C durante 48 horas.

2. Observar los tubos de Hoyer. Si algo creció en ellos, estríe para el aislamiento sobre el medio YGC. Incube a 30º C durante 48 horas.

3. Observe las morfologías de las colonia. Si hay tipos distintos de colonias sobre los platos, tome de cada colonia y estríe para el aislamiento sobre los platos de YGC. Incube a 30º C durante 48 horas. Si hay un sólo tipo de morfología en las colonia, seguir a las pruebas. (NOTA: Cada período de laboratorio antes de la realización de cualquier prueba, siempre estar preparado para estríar de nuevo para asegurar la continuación de la línea de bacteria.)

4. Realice estas pruebas para verificar la identidad de la bacteria.

* Hacer un montaje mojado para determinar la motilidad.

* Hacer una tinción Gram de la bacteria. Esto también permitirá ver fácilmente la forma de la célula.

* Hacer una tinción de endospora. Trate de usar la colonia más vieja para asegurar que las endosporas se hayan formado.

* Realizar la prueba de la catalasa.

* Realizar la prueba de la oxidasa.

5. Utilizando una aguja lo más recta posible, realice una punción de motilidad. Incube durante 48 horas a 30º C. Observe los resultados. Puede ser provechoso sostener el tubo a la luz hasta confirmar el crecimiento lejos de la puñalada.

6. Obtenga dos tubos de fermentación de glucosa por muestra e inocule con la bacteria. Etiquete un tubo como fermentativo y otro oxidativo. Para el tubo fermentativo, con cuidado vierta el aceite mineral hasta que esto forme una capa de aproximadamente 1 cm de espesor. Incube durante 48 horas a 30º C. Observe los resultados.

7. Obtener dos tubos Durham por muestra e inocular con la bacteria. Con cuidado vierta el aceite mineral en cada tubo hasta que una capa de aproximadamente 1 cm de espesor sea formada. Incube durante 24 horas a 30º C. Observe los resultados.

Ejemplo: Medios específicos para

Acetobacter aceti

Medio RAE (Sokollek et al., 1998)

Glucosa 40 g

Extracto levadura 10 g

Peptona 10 g

Fosfato sódico 3,38 g

Ácido cítrico 1,5 g

Etanol 20 ml

Ácido acético 10 ml

Agar 10 g

Agua 1 Litro

Acetobacter puede distinguirse en laboratorio por el crecimiento de colonias en un medio conteniendo 7 % etanol y suficiente carbonato de calcio para hacer al medio parcialmente opaco. Cuando las colonias de Acetobacter forman suficiente acético del etanol, el carbonato cálcico (CO3Ca) alrededor de las colonias se disuelve, formando una zona clara muy apreciable

Medio Manitol

D-Manitol 25 g

Extracto levadura 5 g

Peptona 3 g

Agar 15 g

Agua 1 Litro

Para asegurar la mezcla y el aporte de oxígeno, el medio debe mantenerse agitado durante 48 horas una vez inoculada la bacteria.

Un Nuevo medio permite el aislamiento de la bacteria del ácido acetico dentro de un período de tres días y la diferenciación entre Gluconobacter y Acetobacter dentre de 48 horas. Un agar de Dextrose Sorbitol Mannitol (DSM) fué inventado pas permitor la diferenciación de Gluconobacter y Acetobacter basado en oxidación prefrencial de fuentes de carbon. Es selectivamente alcanzado por acidificación e incorporación de de cicloheximida para inhibir le crecimiento de levaduras y moho. Para minimizar la interferencia de otra bacteria Gram positiva tolerante, los mejores resultados fueron onbtenidos con la adición de 29.5 microgramos de verde brillante(brilliant green) o 0.1g de desoxicolato de sodio por litro de medio. D.S.M. ha sido ha sido utilizado en laboratorioscomo medio para selección y diferenciación en procesos de control de calidad de bebidas.

Resultados esperados

Se espera lograr el aislamiento de alguna especie de acetobacter y determinar sus características morfológicas. Además determinar la eficacia de diferentes medios, para comprobar si los expuestos en el protocolo son los más idóneos.

Presupuesto

Materiales | Precio |

Ygc Agar | 84.83 |

Medio de hoyer | 308.57 |

Autoclave | 7000.00 |

*Frutas | 20.00 |

Destilador | 700.00 |

*Instrumentación | 250.00 |

Microscopio | 600.00 |

Pesa analítica | 750.00$ |

| |

Total | 9713.40$ |

*Frutas: se tomaran distintas frutas para determinar las distintas especies de acetobacter en frutas variadas

*Instrumentación: Esto incluye lo que sería la cristalería, azas, placas, y reactivos de tinción

CRONOGRAMA

Adquisición de reactivos y materiales. 1 mes

Selección de sitios de muestra 2 semanas

Colecta de insectos 1 mes

Aislamiento de bacteria 1,5 meses

Maduración, identificación y preservación 3 meses

Reporte

Bibliografía

1. http://terpconnect.umd.edu/~asmith/emsarapay/protocol.html

2. http://www.sre.urv.es/web/amb/WINEGAR/Meetingdocs/guillamon.pdf

3. http://www.scribd.com/Fermentaciones-aerobicas-especiales/d/13167007