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Purificacion De Proteinas

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Categoría: Ciencia

Enviado por: Rebecca 02 junio 2011

Palabras: 8045 | Páginas: 33

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o intracelulares. C. Desarrollar una técnica de análisis. Para la determinación rápida de la pureza, actividad o contenido total de proteína. Un método frecuentemente utilizado para evaluar la pureza es la separación de la proteína mediante electroforesis. D. Minimizar la manipulación de la muestra. Evitar los procedimientos largos, ya que se corre el riesgo de perder la actividad de la proteína o reducir el rendimiento. E. Remover al inicio del proceso los posibles contaminantes. Como por ejemplo las proteasas. F. Reducir el uso de aditivos. El uso de muchos y diversos aditivos como sales y amortiguadores en cada paso, puede llevar a la pérdida de la actividad de la enzima y aumentar los costos de la purificación. Seleccionar y usar sólo lo necesario. G. Usar una técnica diferente en cada paso. Para ello tomar en cuenta las propiedades fisicoquímicas de la proteína como tamaño, carga, hidrofobicidad y especificidad por ligandos. H. Minimizar el número de pasos. En cada paso se pierde proteína y tiempo, por lo que hay que combinar los pasos de manera lógica.

Un protocolo típico de purificación de una proteína intracelular utiliza varias técnicas, que pueden incluir en la primera fase, la ruptura de las membranas celulares, la centrifugación diferencial o en gradiente de densidad para separar proteínas de las partículas subcelulares o bien de agregados de diferente peso molecular. Una purificación posterior incluirá la precipitación selectiva de proteínas por la adición de sales o solventes miscibles en agua. En la tercera fase de la purificación se removerán los contaminantes utilizando la separación basada en la carga, tamaño y afinidad de la proteína. A continuación se describen brevemente las tres fases del proceso y algunas técnicas para purificar una proteína. SELECCIÓN DE LA FUENTE DE LA PROTEÍNA. Varias pueden ser las fuentes de la proteína, microorganismos, tejidos, cultivos celulares, células transformadas1, entre otras. La elección de la procedencia de la proteína debe basarse en criterios tales como la facilidad de obtener cantidades suficientes de biomasa de la que se aísla la proteína, la cantidad de la proteína de interés en el tejido o célula, y cualquier propiedad peculiar de la proteína escogida, que ayudará en su estabilización y su aislamiento. En algunos casos, el investigador necesita forzosamente utilizar un tejido en particular, aún cuando la cantidad del tejido y de la proteína es insuficiente. La recomendación para estos casos, es realizar un ensayo piloto con una fuente de proteína distinta a la requerida. PRIMERA FASE. El objetivo inicial es la obtención del homogeneizado o extracto crudo y su clarificación o concentración. La homogeneización es un proceso donde las células y los tejidos son lisados en fragmentos lo suficientemente pequeños para dar lugar a una suspensión uniforme y estable llamada homogeneizado. Los equipos con los que se realiza la homogeneización son diversos y comprenden desde el mortero hasta las ondas ultrasónicas pasando por la licuadora. El método a utilizar para obtener el homogeneizado depende de la dificultad que presente el material biológico para romperse. Igualmente importante al método de homogeneización es la selección de la solución de homogeneización, puesto que será el medio al que estará expuesta la proteína y en el que se pueden adicionar componentes que ajusten el pH de la solución, la fuerza iónica, inhibidores de proteasas o algún estabilizador de la proteína. Posteriormente, para eliminar los contaminantes o clarificar la muestra se puede recurrir al proceso de centrifugación. La centrifugación aprovecha las propiedades de tamaño, forma y densidad de las proteínas para separarlas de otras moléculas que presentan características distintas. Como resultado, el efecto de la gravedad para cada proteína es diferente. En principio, se pueden separar organelos de una solución homogénea de partículas, al exponer a la muestra a diferente fuerza gravitatoria. Después de la centrifugación, algunas de las partículas que normalmente permanecían en solución se sedimentan. La fuerza centrífuga relativa (RCF) se calcula con la siguiente ecuación:

Donde RPM son las revoluciones por minuto de un rotor con una distancia r (expresada en mm). El radio usado es la distancia del centro del eje del rotor a la posición intermedia del tubo. La fuerza centrífuga creada puede ser tan pequeña como 600 Xg (600 veces la gravedad) sedimentando pedazos de tejido, células intactas, núcleos, entre otros. El líquido residual o sobrenadante puede someterse a un paso posterior de centrifugación, en un proceso denominado centrifugación diferencial. Esto es varios pasos secuenciales de centrifugación a diferentes

1 Células que fueron obtenidas a través de la introducción de un gene que codifica para una proteína distinta a la suya, a través del uso de técnicas de biología molecular. Ver sección 5 del manual.

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velocidades. Por ejemplo, después de sedimentar lo más pesado, el sobrenadante se puede centrifugar a una velocidad intermedia para sedimentar las membranas celulares o velocidades tan grandes como 300,000 Xg, en donde la mayor parte de las moléculas solubles permanecen en solución y las moléculas ligeras sedimentan. SEGUNDA FASE. El objetivo principal es remover una cantidad importante de contaminantes que pueden ser proteínas, ácidos nucleicos, toxinas y virus. Uno de los métodos más utilizados para eliminar proteínas contaminantes es el de la precipitación. Para que una proteína precipite debemos modificar el ambiente que le rodea, debido a que los grupos cargados en la superficie de una proteína pueden interaccionar tanto con las moléculas de agua como con los iones que se encuentran en solución. Existen varias estrategias para precipitar a las proteínas, cambio de pH, incremento en la temperatura, adición de solventes, moléculas cargadas, etc. Pero, el método más comúnmente empleado es la precipitación por salado con (NH4)2SO4. Las proteínas globulares aumentan su solubilidad al incrementar la concentraciones de iones, fenómeno denominado de “salting in”. Pero cuando se eleva en exceso la concentración de iones, la disminuye la solubilidad de las proteínas y precipitan (“salting out”). El mecanismo del salting-out se basa en la exclusión del cosolvente, en este caso la sal. La mayor parte de las proteínas presentan una capa de agua (capa de solvatación) que se encuentra asociada y cercana a su superficie. Al incrementar la concentración de los iones la capa de solvatación disminuye y permite que los iones interaccionen con los residuos de las proteínas. Las interacciones de tipo hidrofóbico entre los residuos apolares de la proteína y el solvente, se evitan gracias al plegamiento o bien por la asociación entre proteínas, produciendo su precipitación. Debido al uso extensivo de este método, que además es muy económico, se han diseñado tablas y formulas en las que se pueden determinar las cantidades a añadir de (NH4)2SO4 sólido o en solución, a una mezcla de proteínas para obtener una concentración dada. Después de la precipitación hay que retirar el agente precipitante. Una manera es diluir la solución para reducir la concentración del compuesto, otras formas pueden ser realizar la diálisis, la ultrafiltración o bien el paso por una columna de exclusión molecular. La diálisis suele llevarse a cabo colocando la muestra en un tubo estándar de diálisis, usualmente una membrana semipermeable de celulosa o celofán con un poro determinado. Se sumerge la bolsa de diálisis que tiene la muestra en una solución al menos 30 veces mayor al volumen de la muestra. La difusión de los materiales hacia adentro y fuera de la bolsa de diálisis permitirá reducir la concentración de la sal precipitante, disolver a la proteína, así como cambiar la solución en la que originalmente estaba la proteína. Existen dos desventajas de la diálisis, el costo de la membrana de diálisis y que el proceso puede llevar al menos 12 h. Por su parte, la filtración en gel no tiene el problema del tiempo. Una columna empacada con Sefadex-G25® puede usarse para eliminar moléculas de peso molecular menores a 5000 daltones. La muestra se coloca en la columna, las moléculas de menor tamaño entran por los poros de la matriz, mientras que las grandes son excluidas, por lo que al adicionar el amortiguador de elución, las proteínas de alto peso molecular se mueven con rapidez a través de la columna y salen primero, después eluyen o salen las de peso molecular menor. En un simple paso la muestra se desala, concentra, cambia de amortiguador y pierde proteínas o moléculas contaminantes. TERCERA FASE. El objetivo es obtener una proteína pura o con mínimas trazas de contaminantes. Para alcanzar el objetivo se utilizan uno o la combinación de varios métodos cromatográficos, como la 3

cromatografía de exclusión molecular, intercambio iónico, interacción hidrofóbica y de afinidad. A continuación sólo se describen las dos técnicas que se usarán en el laboratorio. La cromatografía de intercambio iónico es una técnica que separa las biomoléculas en base a sus características de carga. Los grupos cargados sobre la superficie de una proteína interaccionan con los grupos con carga opuesta de la fase estacionaria. La carga electrostática de las proteínas depende del pH en el que se encuentren, cuando se iguala el número de cargas positivas a las negativas se dice que se encuentran en su punto isoeléctrico o pI. La carga neta de una proteína es positiva a valores de pH < pI, y se une fuertemente a una resina con cargas negativas o intercambiador catiónico. Mientras que, para que la proteína presente carga negativa la solución debe encontrarse en valores de pH > pI, y es capaz de unirse a intercambiadores de tipo aniónico que contienen grupos cargados positivamente (Figura 2.1). Para eluir a la proteína de interés se utilizan soluciones que modifican el pH o la concentración de sales en la resina. Debido a que la separación de las proteínas de la matriz ocurre en orden de menor a mayor fuerza de unión, es común eluir a las proteínas usando un gradiente de concentración de sales en orden creciente de concentración.

Figura 2.1. Separación por cromatografía de intercambio iónico. Dependiendo de la carga iónica de los soportes o resinas de cromatografía entonces ocurrirá la interacción con moléculas cargadas positiva o negativamente. Cromatografía de afinidad. Si la proteína a purificar tiene una afinidad específica por un ligando como su cofactor, un anticuerpo o un ión metálico, esa propiedad se puede usar para purificar a la proteína. Por ejemplo, para purificar a una deshidrogenasa es común usar al cofactor de la enzima, el NAD+ o bien a un compuesto que presente alguna similitud a éste (Figura 2.2). Cuando la muestra atraviesa la columna de afinidad, la proteína de interés se unirá al ligando, mientras que el resto sale de la columna. Este tipo de separación, basada en el reconocimiento biológico, es muy específica y elimina a muchos contaminantes.

A

B

Figura 2.2. Comparación entre las moléculas de Cibacrón blue 3GA y el NAD+. A) Los colorantes de triazina como el Cibacrón blue 3GA son comúnmente acoplados a resinas de agarosa para utilizarse en ensayos de purificación por cromatografía de afinidad. La molécula es estable, fácil de movilizar, barata y varias compañías las tienen disponibles para realizar purificaciones de proteínas que unen nucleótidos de piridina como B) el NAD+. 4

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Sección 2. ESTRUCTURA Y PROPIEDADES DE PROTEÍNAS

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En la práctica se purificará a la enzima lactato deshidrogenasa (LDH) de músculo de bovino. En la primera parte del protocolo de purificación, se realizará la clarificación de la muestra mediante filtración y centrifugación y posteriormente se llevarán a cabo dos pasos secuenciales de precipitación con (NH4)2SO4. En la siguiente sesión se realizará el desalado de la muestra para al final purificarla mediante una columna de intercambio iónico o de afinidad. Por último, en la tercera parte del protocolo se evaluará la pureza de la proteína y el rendimiento, al determinar la cantidad total de proteína y su separación y visualización en un gel de poliacrilamida-SDS. Material biológico 100 g de carne de res preferentemente de ternera Materiales y equipo para la extracción de la enzima (por grupo) 1 Tijeras 1 Espátula 1 Recipiente para hielo 1 Par de guantes de látex Colador de aluminio Gasa 2 Vasos de precipitados de 2 L 1 Probeta de 100 mL 4 Botellas de centrífuga Licuadora Balanza granataria Balanza de dos platos Materiales y equipo para la precipitación con sulfato de amonio 2 Tubos para centrífuga con capacidad para 50 mL 1 Recipiente para hielo 2 Vasos de precipitados de 100 mL 1 Espátula Tubos para microfuga de 1.5 mL Gradilla para tubos de microfuga 1 Caja con puntas de 200 µL (amarillas) para micropipeta. 1 Caja con puntas de 1000 µL (azules) para micropipeta. 1 Micropipeta 20-200 µL 1 Micropipeta 200-1000 µL 1 Bandeja pequeña 1 Barra magnética 1 Agitador magnético Centrífuga (por grupo) Balanza (por grupo) Caja para almacenar tubos de microfuga en el congelador (por grupo) Reactivos − 0.03M KOH. − (NH4)2SO4 sólido.

Desarrollo experimental Importante. Todo el procedimiento deberá realizarse en frío (4°C). Mantener las soluciones y suspensión proteica en baño de hielo. Anotar en su libreta el peso del tejido utilizado, así como el volumen de la solución de homogeneización y los volúmenes resultantes después de cada uno de los pasos de purificación (Figura 2.3). Valores necesarios para calcular el rendimiento, contenido de proteína y actividad enzimática. A. Extracción. Esta primera parte la realizará el profesor con ayuda de un par de voluntarios y se distribuirá el homogeneizado a todos los equipos. 1. Cortar en trozos pequeños 100 g de tejido (eliminar el tejido graso que acompaña a la carne) y colocarlos en un vaso de licuadora previamente enfriado (mantener el vaso en el cuarto frío hasta su uso). 2. Agregar 10 volúmenes de 0.03 M KOH por cada g de tejido y licuar brevemente, hacerlo en pulsos de 10 seg para evitar que la licuadora se caliente. 3. Debido a la textura del homogeneizado, se recomienda primero filtrar en una malla gruesa (colador de aluminio) y después filtrar la mezcla sobre cuatro capas de gasa grandes (previamente humedecidas con agua destilada). Exprimir suavemente y colectar el filtrado en un vaso de precipitados de 1L. El procedimiento tarda cuando el tejido utilizado tiene mucha grasa y/o nervios. NOTA. Puede tomarse una alícuota de está fracción y denominarla Fracción 0, sólo hay que tener en cuenta que al tener mucho tejido conectivo y grasa forma una masa gelatinosa que es difícil tomar con la punta de la micropipeta para medir la concentración de proteínas. 4. Distribuir el filtrado en botellas de centrífuga Centrifugar a 10,000 rpm a 4°C durante 10 minutos. Decantar con cuidado el sobrenadante en un vaso de precipitados de 2 L, el botón tiene una consistencia gelatinosa y está muy laxo. Al sobrenadante lo denominamos homogeneizado total (Fracción 1). Apartar 1 mL de la fracción 1 en un tubos de microfuga y almacenar a -20ºC para su posterior uso. Nota: Tirar el contenido de la gasa en el recipiente preparado para su deshecho. B. Precipitación con sulfato de amonio por equipo. 5. Tomar 30 mL de la fracción 1 y colocarlo en un vaso de precipitados. 6. Agitar el sobrenadante de manera continua en un agitador magnético, mientras se añade lentamente sulfato de amonio sólido (calcular la cantidad a añadir considerando 0.258 g de (NH4)2SO4 por cada mL del sobrenadante). La agitación debe ser lo suficientemente vigorosa para evitar la formación de cúmulos de sal no disueltos, pero no demasiado fuerte porque se puede producir espuma, en ningún momento utilizar varilla de vidrio o espátula para disolver los grumos. Se recomienda colocar una bandeja pequeña con hielo entre el vaso de pp y la parrilla de agitación para evitar que la solución se caliente. 7. Cuando toda la sal se ha disuelto la solución se encuentra a una saturación del 45% con sulfato de amonio. 8. La mezcla que ahora se encuentra turbia se vacía a un tubo de centrífuga de 50 mL y se centrífuga a 10,000 rpm 4°C por 10 minutos. 9. Colectar el sobrenadante (Fracción 2) y medir el volumen. Descartar el botón. Tomar 1 mL de la fracción 2 y almacenarla en un tubos de microfuga a –20°C para su posterior uso. 10. Calcular el peso de (NH4)2SO4 para obtener una solución al 72% de saturación, (considerar 0.19 g de (NH4)2SO4 por cada mL del sobrenadante obtenido). Agitar como se describió anteriormente. 11. Una vez disuelto el (NH4)2SO4, colocar la mezcla turbia en un tubo de centrífuga. Centrifugar a 10,000 rpm a 4ºC por 5 min y descartar el sobrenadante. 12. Resuspender el botón en 1 mL de agua, el volumen final es de aproximadamente 1.8 mL. 6

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0141BIOQUÍMICA EXPERIMENTAL Sección 2. ESTRUCTURA Y PROPIEDADES DE PROTEÍNAS 13. Distribuir en 3 tubos de microfuga y etiquetar como Fracción 3. Uno de los tubos debe contener 750 µL, se usará ese volumen en el siguiente protocolo experimental. Almacenar a –20°C. SUGERENCIAS: 1. Para evitar la congelación y descongelación innecesaria de las muestras es conveniente que al final de está sesión se almacenen en alícuotas las muestras y que se etiqueten apropiadamente, se sugiere el uso de la tabla que abajo se muestra. 2. Se recomienda sólo descongelar la alícuota una sola vez y después desecharla. 3. La alícuota para la determinación de proteínas de las fracciones 0, 1, 2, 3 y 4 se recomienda que sea una dilución de la fracción de al menos 1:2 y con 100 µL que se almacenen de ella es suficiente. 4. Para el corrimiento electroforético de las fracciones se pueden almacenar 100 a 150 µL de muestra. 5. La alícuota para la determinación de actividad enzimática puede ser de 200 µL.

Número de Determinación Fracción de proteínas. Alícuota almacenada para: PAGE-SDS Curva Obtención de temporal de parámetros actividad cinéticos. enzimática. II III IV ⎯ ⎯ ⎯ ⎯ ⎯ ⎯ Desalado Volumen total almacenado

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_____g Tejido ______mL 0.03 M KOH Moler Homogeneizado Filtrar con malla de aluminio Filtrar con gasa

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Homogeneizado Distribuir en botellas de centrífuga Centrifugar 10,000 rpm, 10 min, 4°C Botón Sobrenadante (SN) __________mL VOLUMEN TOTAL (FRACCIÓN 1; _________mL) A _______mL SN añadir ________g (NH4)2SO4 (45% saturación) Agitar

I

0 1 2 3 4* FPA* FPB*

⎯ ⎯ ⎯ ⎯ ⎯ ⎯ Botón Sobrenadante (FRACCIÓN 2;_________mL) Añadir ________g (NH4)2SO4 (70% saturación) Agitar Recuerda que ya está al 45% de la sal Distribuir en tubos de centrífuga Centrifugar 10,000 rpm, 10 min, 4°C

* Fracciones que se obtendrán en la siguiente sesión

Distribuir en tubos de centrífuga Centrifugar 10,000 rpm, 5 min, 4°C Botón Sobrenadante (FRACCIÓN 3) Añadir 1 mL de H20; volumen total obtenido______mL

Figura 2.3 Esquema de purificación inicial de la lactato deshidrogenasa mediante precipitaciones sucesivas con sulfato de amonio. Se sugiere llenar los espacios vacíos con las cantidades solicitadas. 7 8

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0141BIOQUÍMICA EXPERIMENTAL Notas y Cálculos.

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Cuestionario 1. ¿Mencione cuatro usos que se les puede dar a las proteínas purificadas? 2. Dentro de la guía para purificar a una proteína se plantea que es importante establecer cuál va a ser el uso final de la proteína purificada. Explique por qué. 3. Clasifique los métodos que se seguirán para la purificación de la lactato deshidrogenasa, de acuerdo a las propiedades de las proteínas como carga, peso y solubilidad. 4. Es posible clasificar a todos los métodos para purificar a una proteína sólo de acuerdo a las propiedades mencionadas anteriormente. Explica 5. ¿Por qué es importante mantener a la mezcla de proteínas a 4°C? 6. ¿Qué otro método de homogeneización sería recomendable utilizar para obtener las proteínas del músculo? 7. Investiga cuáles son las propiedades de la lactato deshidrogenasa, como secuencia primaria de aminoácidos, pI, actividad enzimática que cataliza, peso molecular, estructura terciaria y/o cuaternaria. 8. Existen varios métodos en la literatura para purificar a la lactato deshidrogenasa, ¿por qué existe esa variedad si todos purifican a la misma proteína?. 9. ¿Cuáles son las proteínas que se están purificando con un fin de uso farmacéutico o médico? Referencias • Allen T, Mark W. 2004. Desalting, Concentration, and Buffer Exchange by dialysis and ultrafiltration. Current protocols in protein science 4.4.1-4.4.15. John Wiley & Sons Inc, New York, USA. • Castle DJ. 2004. Overview of cell fractionation. Current protocols in protein science 4.1.1-4.1.9. John Wiley & Sons Inc, New York, USA. • Devlin TM. Textbook of biochemistry with clinical correlations. Cuarta edición. 1997. John Wiley & Sons Inc, New York, USA. Pp 69-85. Localización QP514.T4 • Protein purification Handbook. 1999. Amhersham Pharmacia Biotech AB. Uppsala, Sweden. Code number 18-1132-29 Pp 94. • Salem J. 2001. Enzymes: purification. Encyclopedia of life sciences. John Wiley & Sons Ltd. Pp 1-7. Consultar la página www.els.net • Sheehan D, O’Sullivan S. 2001. Ion exchange chromatography. Encyclopedia of life sciences. John Wiley & Sons Ltd. Pp 1-4. Consultar la página www.els.net • Voet D, Voet JG. Biochemistry. Segunda edición. 1995. John Wiley & Sons Inc, New York, USA. Pp 71-104

Sitios recomendados para 1. aprender sobre las características y propiedades de las proteínas http://depa.pquim.unam.mx/proteinas/estructura/index.html página desarrollada por el Dr. Rogelio Rodríguez Sotres. 2. calcular la concentración de sulfato de amonio a añadir a una muestra. http://www.encorbio.com/protocols/AM-SO4.htm 3. calcular la fuerza centrífuga de un rotor. Convierte rpm a Xg o vicerversa. http://www.gmi-inc.com/archivedpages/Rotor%20RCF%20Calculator.htm

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PARTE II. PURIFICACIÓN POR CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO Y DE AFINIDAD

Objetivos - Aplicar la cromatografía en filtración en gel como una de las técnicas para el desalado de extractos proteicos. - Aplicar los métodos de cromatografía de intercambio iónico y por afinidad para purificar una proteína. Material biológico Fracción 3 obtenida en la sección anterior Material y equipo 1 Columna de cromatografía vacía 1 Columna de cromatografía pre-empacada con Sephadex G-25* 1 Probeta de 50 mL 4 tubos de vidrio de 13X100 mm Tubos para microfuga de 1.5 mL 1 Gradilla para tubos de microfuga 1 Recipiente para hielo 1 Soporte universal 1 pinzas de tres dedos de sujeción con nuez Micropipeta de 1000 µL Micropipeta de 200 µL 1 caja de puntas de 1000 µL para micropipeta 1 caja de puntas de 200 µL para micropipeta Adaptadores para tubos de 15 mL (por grupo) Centrífuga (por grupo) Balanza (por grupo) Reactivos Desalado − 2.5 % Sephadex-G25 (p/V). La columna contiene 1 mL de volumen de cama de Sephadex, preparado según se indica en el Apéndice. Se entrega pre-empacada para su uso inmediato. − Amortiguador Tris-β-Mercaptoetanol. Contiene 10 mM de Tris/HCl pH 8.8 y 0.5 mM βMercaptoetanol. Ver preparación en el apéndice. − 400 mM PMSF − Amortiguador Tris--β-Mercaptoetanol-PMSF (Amortiguador Tris-β-Mercaptoetanol + 1 mM de PMSF). Los alumnos la prepararan poco antes de su uso. Tomar un volumen adecuado del amortiguador Tris-β-Mercaptoetanol y añadir PMSF para una concentración final de 400 mM. Determinar el volumen a preparar por cada equipo ya que no todos los equipos realizarán la cromatografía de afinidad. Ver apéndice. − Agua destilada estéril para el lavado de las columnas. Purificación por cromatografía de intercambio iónico − Matriz para intercambio catiónico, Macro-prep High S de BIORAD (se entregará previamente lavada, ver Apéndice). 11

− Amortiguador de equilibrio. Contiene 50 mM de amortiguador de fosfatos pH 7.0. − Amortiguador de elusión. Contiene 50 mM de amortiguador de fosfatos pH 7.0 y 1 M de NaCl. Purificación por cromatografía de afinidad − DEAE affi-gel blue gel (previamente lavada ver Apéndice). − Amortiguador Tris-PMSF (solución que se uso en el desalado). − Amortiguador de NAD+ . Amortiguador Tris-β-Mercaptoetanol adicionado con 5 mM de NAD+ . Disolver el NAD+ justo antes de usarse, ver apéndice. Desarrollo experimental. Desalado mediante cromatografía de exclusión molecular 1. Tomar 750 µL de la fracción 3 y añadirle 750 µL del amortiguador Tris-PMSF (para reducir la concentración de la sal a la mitad). 2. Sujetar la columna a un soporte universal, ver Figura 2.4. 3. Adicionar a la columna de Sefadex poco a poco la mezcla de proteína y amortiguador del punto 1 y esperar a que entre a la columna por gravedad (aproximadamente 10 min). Posteriormente colocar la columna sobre un tubo de vidrio de 13X100 mm y centrifugar a 3,000 rpm 10 min, 4°C. Se desecha la solución que sale de la columna, proteínas o moléculas que no se retuvieron en la columna. 4. Para eluir las proteínas se adicionan 750 µL de amortiguador Tris-PMSF y se centrifuga a 3000 rpm a 4°C durante 5 min. La fracción que sale contiene a la LDH, Fracción 4. Se mide la cantidad de fracción 4 y se guardan 100 µL para llevar a cabo medición de actividad y determinación de proteína. El resto de la muestra se utilizará en el siguiente paso. NOTAS. 1 La columna se lava con agua destilada estéril y se mantiene hidratada para reutilizarla, entregar al profesor lavada. 2 No es necesario realizar la operación en condiciones de esterilidad, pero el usar agua estéril ayuda a disminuir una posible contaminación de la columna.

Purificación por cromatografía de intercambio iónico o de afinidad. La mitad del grupo realizará la purificación por intercambio iónico de la LDH de la fracción 4 y la otra parte del grupo se enfocará en la purificación de la LDH por columna de afinidad, también a partir de la fracción 4. A. Preparación de la columna para la fase tres de la purificación. Adicionar 2 mL de alguna de las dos matrices que el profesor te proporcionará, para realizar intercambio catiónico o de afinidad. Dejar de drenar o colocar la columna en un tubo de vidrio de 13X100 para centrifugar a 3,000 rpm por 10 min a 4°C. Es importante revisar que no se hayan producido burbujas para que el flujo del líquido sea constante. B. Purificación por cromatografía de intercambio iónico 1. Se utilizará la columna que se preparó en el paso anterior con la matriz de intercambio iónico. 2. Equilibrar la columna adicionando en la parte superior de la columna 1.0 mL de amortiguador de equilibrio. Es muy IMPORTANTE adicionar el volumen lentamente, de manera que el flujo de salida sea gota a gota. Se puede acelerar el proceso centrifugando a 3000 rpm por 5 minutos a 4°C. 12

0141BIOQUÍMICA EXPERIMENTAL Sección 2. ESTRUCTURA Y PROPIEDADES DE PROTEÍNAS Cuando la última gota del amortiguador de equilibrio a salido se adicionan 600 µL de la fracción 4 y se deja que pase el líquido por la columna o se centrífuga como se menciono anteriormente. 4. Para la elución se adicionan 1.0 mL de amortiguador de elución y se recolectan 2 fracciones de 500 µL cada una (Figura 2.4). Las dos fracciones obtenidas las denominamos, Fracción purificada A (FPA) y Fracción purificada B (FPB). Posteriormente, se usaran ambas fracciones. NOTA. Posteriormente se lava la columna con al menos 2 mL de amortiguador de equilibrio y se guarda la columna para ser reutilizada. Entregar al profesor. 3.

0141BIOQUÍMICA EXPERIMENTAL Sección 2. ESTRUCTURA Y PROPIEDADES DE PROTEÍNAS Se repite el paso 5 para recuperar cualquier cantidad de proteína que haya quedado aún unida a la columna (Fracción purificada B o FPA). NOTA. Finalmente se lava la columna con al menos 2 mL del buffer Tris-β-mercaptoetanol, y entregar la columna al profesor para ser utilizada nuevamente. 6. Sugerencia. Si el tiempo lo permite es posible realizar la determinación de proteínas en está sesión para que en la próxima sólo se realice el corrimiento electroforético de las muestras. Cuestionario 1. ¿Por qué es necesario llevar a cabo el proceso de desalado de la fracción 3 del protocolo experimental? 2. ¿Cuáles otros usos tiene la cromatografía de exclusión molecular que no sea la de ayudar a desalar una suspensión de proteínas? 3. Investiga cuál de los métodos de cromatografía es más caro, intercambio iónico o de afinidad. 4. De acuerdo a lo anterior menciona que procedimiento es el que elegirías como primera instancia. 5. ¿Qué propiedad de la proteína se utiliza para purificar a la proteína mediante una columna de intercambio catiónico? 6. ¿Porqué el eluyente para la cromatografía de intercambio iónico contiene NaCl? 7. ¿Podrías usar otra solución diferente de elución? Si es así menciónala y explica porque. 8. ¿Qué propiedad de la proteína estás utilizando para purificarla por cromatografía de afinidad? 9. ¿Porqué el eluyente para la cromatografía de afinidad es el NAD+? Referencias • Devlin TM. Textbook of biochemistry with clinical correlations. Cuarta edición. 1997. John Wiley & Sons Inc, New York, USA. Pp 69-85. Localización QP514.T4 • Protein purification Handbook. 1999. Amhersham Pharmacia Biotech AB. Uppsala, Sweden. Catálogo 18-1132-29 Pp 94. • Salem J. 2001. Enzymes: purification. Encyclopedia of life sciences. John Wiley & Sons Ltd. Pp 1-7. Consultar la página www.els.net • Sheehan D, O’Sullivan S. 2001. Ion exchange chromatography. Encyclopedia of life sciences. John Wiley & Sons Ltd. Pp 1-4. Consultar la página www.els.net • Voet D, Voet JG. Biochemistry. Segunda edición. 1995. John Wiley & Sons Inc, New York, USA. Pp 71-104 Sitios recomendados para 1. aprender sobre cromatografía • http://www.ub.es/biocel/wbc/tecnicas/cromatografia.htm 2. realizar una autoevaluación sobre los fundamentos de la cromatografía • http://www4.ujaen.es/~acarrera/TBQ_HotPot/T3_TBQ_VF/T3_TBQ_VF.htm

Figura 2.4 Purificación de proteínas por cromatografía líquida. A. Empacado de la columna y B. Colecta de fracciones de proteína después de añadir la solución de elución. C. Purificación por cromatografía de afinidad. 1. Se utiliza una columna pre-empacada con DEAE Affi-gel Blue. 2. Se equilibra la columna al adicionar 1 mL de amortiguador Tris-PMSF, el volumen que drena se desecha. Para acelerar el proceso de paso de las soluciones en la columna se puede centrifugar a 3000 rpm por 5 min a 4°C. 3. Enseguida se adicionan 600 µL de la fracción 4. Se centrífuga a a 3000 rpm por 5 min a 4°C o se deja drenar, se desecha el eluído. 4. Añadir 600 µL del amortiguador Tris-PMSF para eliminar a las proteínas que no se han unido a la columna. Centrifugar nuevamente a 3000 rpm por 5 min a 4°C. 5. Para despegar a la LDH de la columna se adicionan 400 µL de buffer de NAD+ y se recolecta el volumen en un tubo de microfuga (Fracción purificada A o FPA). 13

14

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0141BIOQUÍMICA EXPERIMENTAL Fracciones 0 a la 4 y FPA y FPB Material y equipo 1 Recipiente para hielo 1 Vaso de pp de 25 mL Celdas de vidrio para espectrofotómetro Tubos para microfuga de 1.5 mL 1 Vórtex Micropipeta de 200-1000 µL Micropipeta de 20-200 µL 1 caja de puntas de 1000 µL para micropipeta 1 caja de puntas de 200 µL para micropipeta 1 piceta con etanol y una con agua bidestilada. 1 gradilla para tubos de microfuga Espectrofotómetro

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• Parte III. Monitoreo del proceso de purificación. Determinación de la concentración de proteínas y separación por electroforesis en gel de poliacrilamida- SDS

Objetivos − Conocer los métodos que se utilizan para monitorear el proceso de purificación de una proteína. − Adquirir la habilidad para analizar el progreso de la purificación de una proteína. − Determinar la concentración de una proteína utilizando un método colorimétrico: Determinación de proteínas por Bradford. − Aplicar la electroforesis como una herramienta para monitorear la pureza de una proteína. − Analizar el progreso de la purificación de una proteína. − Conocer algunos parámetros que se determinan durante la purificación de una proteína: rendimiento y pureza. − Aplicar el conocimiento adquirido para elaborar esquemas de purificación de proteínas. Introducción Para evaluar el rendimiento y pureza de una enzima es necesario contar con una técnica para que específicamente detecte o mida la cantidad de la proteína blanco. En casos raros, la proteína blanco es fácil de detectar, porque es colorida (mioglobina) o porque es fluorescente (proteína verde fluorescente). Cuando la proteína es una enzima, como la lactato deshidrogenasa, se puede realizar un ensayo enzimático específico para determinar si estamos llevando a cabo la purificación de manera adecuada (se realizará en la sección 3 del manual). Para las proteínas que no son enzimas, el ensayo se basa en medir la actividad biológica de la proteína. Debido a que el ensayo específico para la proteína no nos da información sobre los otros contaminantes proteicos, es necesario un ensayo adicional que determine la cantidad total de proteína. Otra técnica que es muy usada para el análisis de la pureza de las proteínas es la electroforesis, aunque también se pueden emplear las técnicas de HPLC o Western Blot. A continuación se da una breve explicación del fundamento de la determinación de proteínas por el método de Bradford y de la separación de proteínas por electroforesis. La determinación de proteínas por Bradford es ampliamente usada ya que es simple, rápida, barata y sensible. El método tiene se basa en la unión específica del colorante azul de Coomassie brillante G250 (CBBG) a los residuos de Arg, Trp, Tyr, His y Phe de las proteínas. El CBBG se une a los residuos de las proteínas produciendo una absorbancia máxima a 595 nm, mientras que el colorante libre tiene una absorbancia máxima a 470 nm. A diferencia del Lowry que es muy sensible a la composición de la solución que acompaña a las proteínas, el Bradford sólo es afectado por algunos detergentes. Una de las desventajas del Bradford es que el colorante CBBG se une fuertemente a las cuvetas de cuarzo, es por ello que se recomienda usar vidrio o cuvetas de plástico. Al usar cuvetas de plástico se facilita su limpieza con un poco de alcohol.

Reactivos Reactivo de Bradford Solución estándar de albúmina de suero bovino (BSA) 0.1mg/mL. Desarrollo experimental Determinación colorimétrica de proteínas por el método de Bradford. Se utilizará una curva estándar de albúmina de suero bovino (BSA) y las muestras se harán por duplicado, utilizando tubos de microfuga para hacer las mezclas de ensayo. 1. 2. Descongelar sólo las alícuotas de las fracciones de proteína destinadas para este protocolo y que fueron recolectadas durante la purificación de la lactato deshidrogenasa. Mantener las fracciones en un recipiente con hielo durante todo el experimento. Recordar que ya se hizo una dilución previa y si es necesario hacer una dilución adicional ser cuidadosos al calcularla. Numerar los tubos según se indica en la tabla 2.1, después añadir los reactivos en el orden mostrado, agitando después de cada adición. ¡Precaución, maneja con cuidado el reactivo de Bradford, ya que contiene H3PO4!. Registrar la absorbancia a 595 nm. Graficar absorbancia del estándar vs cantidad de proteína (µg). Utilizar los parámetros de regresión obtenidos de la curva, para calcular el contenido de proteína de cada una de las muestras de acuerdo a la siguiente fórmula. Colocar los datos en la tabla 2.1 ⎛ Abs λ 595 nm − b ⎞ Contenido de proteína ( µg / µL) = ⎜ ⎜ pendiente ⎟ / µL muestra ⎟ ⎝ ⎠

3.

4. 5. 6.

Determinación de proteínas Material biológico. 15 16

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Tabla 2.1. Determinación de la concentración de proteína de las fracciones obtenidas durante los diferentes pasos de la purificación de la LDH de músculo esquelético de bovino. F corresponde a Fracción y conc a que la muestra se usará concentrada.

Tubo H2O (µL) BSA (µL) F0 1:2 (µL) F1 1:2 (µL) F2 1:10 (µL) F3 1:10 (µL) F4 1:5 (µL) FPA FPB conc conc (µL) (µL) Reactivo de Bradford (µL) Absorbancia a 595 ηm Proteína (µg)

Introducción La electroforesis de proteínas en geles de poliacrilamida es una herramienta analítica indispensable y rutinaria en un laboratorio de Bioquímica. La electroforesis puede usarse para separar y comparar una mezcla compleja de proteínas, evaluar la pureza de una proteína durante el proceso de aislamiento y provee algunos valores aproximados de las características fisicoquímicas de las proteínas como la composición de subunidades, punto isoeléctrico, tamaño y carga. En la electroforesis la migración de las partículas o moléculas cargadas ocurre cuando se establece un campo eléctrico. La velocidad de la migración depende de la fuerza del campo eléctrico aplicado y la carga neta de las moléculas a separar. Si el reservorio de la solución que se encuentra en contacto con la muestra, generalmente llamada amortiguador de corrida, se encuentra en un pH cercano a 9.0, la mayor parte de las proteínas se encontrarán cargadas negativamente, por lo que al aplicar el campo eléctrico migrarán al ánodo. La migración diferencial de las proteínas dependerá no sólo de su tamaño sino también de su carga, pero cuando se trata de un gel en el que se ha incluido un agente desnaturalizante como el dodecil-sulfato de sodio (SDS), se pierde la estructura terciaria y cuaternaria de la proteína y se uniforman las cargas de las proteínas, llevando a que la migración sólo dependa de su peso molecular. Existe una gran variedad en la composición de los geles, que responde a las necesidades de separación de diferentes mezclas de proteínas. En este caso se utilizará a la electroforesis en geles de poliacrilamida-SDS para evaluar el proceso de purificación de una proteína. El gel de poliacrilamida, se hace a partir de la reacciones entre los radicales libres de los monómeros de la acrilamida. Las cadenas de poliacrilamida se entrecruzan con la N,N’-metilen bisacrilamida para formar una red. La tetrametiléndiamina o TEMED es el agente iniciador de la polimerización y el ión persulfato (S2O8-) realiza la función de catalizador con la formación de radicales libres. Las proteínas pequeñas viajan más rápido que las de mayor tamaño, porque el tamaño del poro entorpece el paso de las proteínas de mayor peso molecular. Material biológico Fracción 0 o 1 Fracción 2 Fracción 3 Fracción PA Fracción PB Material y equipo 2 vasos de precipitados 25 mL 1 Pipeta Pasteur con bulbo Tubos para microfuga de 0.5 mL 1 Recipiente para hielo 1 Micropipeta de 2-10 µL 1 Micropipeta de 20-200 µL 1 caja de puntas de 200 µL para micropipeta 1 Recipiente de plástico para la tinción. 1 Cámara para electroforesis 1 Fuente de poder 1 juego de placas de vidrio 1 Peine 1 juego de separadores 18

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19

800 770 760 740 720 700 790 780 790 780 790 780 790 780 790 780 790 780 790 780

0 30 40 60 80 100 — — — — — — — — — — — — — —

— — — — — — 10 20 — — — — — — — — — — — —

— — — — — — — — 10 20 — — — — — — — — — —

— — — — — — — — — — 10 20 — — — — — — — —

— — — — — — — — — — — — 10 20 — — — — — —

— — — — — — — — — — — — — — 10 20 — — — —

— — — — — — — — — — — — — — — — 10 20 — —

— — — — — — — — — — — — — — — — — — 10 20

200 200 200 200 200 200

Proteína (µg/µL)

200 200 200 200 200 200 200 200 200 200 200 200 200 200

7. 8.

9.

Realizar los promedios y colocar los resultados en la Tabla 2.2. Determinar la cantidad de proteína total que se obtuvo de cada una de las fracciones de los diferentes pasos de purificación, para ello multiplicar el volumen total de la fracción por el promedio obtenido en el punto 7, colocar los datos en la Tabla 2.2. Determinar el rendimiento proteico en cada paso de purificación, si tomaste la fracción 0 usa está como el 100% sino usa la fracción 1 como el 100%.

Tabla 2.2. Rendimiento proteico durante las diferentes fases de la purificación de la lactato deshidrogenasa de músculo esquelético de bovino

Fracción 0 1 2 3 4 FPA FPB Promedio µg proteína/µL Volumen total en la fracción (µL) Proteína total en la fracción (µg o mg ) Rendimiento 100%

Separación de las proteínas en gel de poliacrilamida-SDS

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0141BIOQUÍMICA EXPERIMENTAL Pinzas para sujetar las placas

Sección 2. ESTRUCTURA Y PROPIEDADES DE PROTEÍNAS

Reactivos − Acrilamida. Mezcla de 30% acrilamida y 0.8% N’N’metilen-bisacrilamida. − 2 M Tris /HCl pH 8.8 − 0.5 M Tris/HCl pH 6.8 − 20% SDS − TEMED − 10% Persulfato de amonio − Agua destilada − Isopropanol o butanol − Mezcla de estándares de peso molecular de proteínas. − Amortiguador de muestra * − Amortiguador de corrida * − Solución teñidora * − Solución desteñidora * *La composición de las soluciones se encuentra en el apéndice. Desarrollo experimental Preparación del gel de poliacrilamida-SDS. 1. Se lavan perfectamente las placas de vidrio. Ensamblar las dos placas de vidrio con los separadores. Hay que asegurarse de que queden bien niveladas y fijas las placas con las pinzas. 2. Se hace una marca a los 2/3 de la capacidad de los vidrios (ver Figura 2.5). 3. Se mezclan los componentes del gel separador que se indican en la Tabla 2.3, añadiendo al final el persulfato de amonio y el TEMED. Agitar cuidadosamente la solución (USAR GUANTES MIENTRAS SE MANIPULE LA ACRILAMIDA). Tabla 2.3. Minigel en placa al 12 % de acrilamida con SDS. Reactivos Gel separador Gel concentrador 0.66 mL ⎯ 0.6 mL 50 µL 3.67 mL 2.5 µL 40 µL 5 mL 30% Acrilamida + 2 mL 0.8% Bisacrilamida 2 M Tris/HCl pH 8.8 1 mL 0.5 M Tris/HCl pH 6.8 ⎯ 10% SDS 50 µL H2O 1.94 mL TEMED* 2 µL 10% Persulfato de amonio* 40 µL Volumen total 5 mL *Añadir justo antes de vaciar entre las placas de vidrio.

0141BIOQUÍMICA EXPERIMENTAL Sección 2. ESTRUCTURA Y PROPIEDADES DE PROTEÍNAS 7. Decantar el isopropanol o butanol y se hace un lavado con agua bidestilada, se elimina el exceso de agua con papel absorbente cuidando de no tocar el gel 8. Preparar la mezcla del gel concentrador similar al punto 2. 9. Se añade entre las placas de vidrio e inmediatamente se coloca el peine en la parte superior para formar los depósitos en los que colocaremos la muestra. 10. Se espera a que se forme este segundo gel, el cual tarda aproximadamente 20 min. 11. Remover con cuidado el peine y se fija el gel con las placas de vidrio a la cámara de electroforesis. 12. Añadir el amortiguador de corrida en ambos reservorios.

Figura 2.5. Pasos a seguir para la preparación de un gel de poliacrilamida-SDS.

4. Añadir inmediatamente la mezcla anterior en el espacio entre las dos placas de vidrio. 5. Agregar poco a poco con la ayuda de una pipeta pasteur isopropanol o n-butanol saturado con agua, con la finalidad de disminuir la tensión superficial y que no se forme un menisco en la parte superior del gel. 6. Se espera a que polimerice la acrilamida, aproximadamente 20 minutos. 19

Preparación de muestras 13. Ya que conoces los µg proteína/µL, calcular cuál es el volumen necesario para tener 35 µg de proteína. Con los datos llenar la tabla 2.4. 14. Descongelar las muestras y colocar el volumen que se calculó en un tubo de microfuga y a ese volumen añadirle un volumen igual de amortiguador de muestra. Es recomendable también, si los volúmenes resultantes son muy diferentes entre muestra y muestra, que al añadir el volumen de amortiguador de muestra ajustemos todos a un volumen similar total. Cabe señalar que los pozos tienen una capacidad máxima de 30 µL por lo que la mezcla proteína:amortiguador de muestra no debe exceder ese volumen. 15. Realizar también una mezcla de estándares de peso molecular. Usar 7 µL del estándar y mezclar con un volumen adecuado de amortiguador de muestra. 20

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Fracción

Sección 2. ESTRUCTURA Y PROPIEDADES DE PROTEÍNAS

Amortiguador Estándar de muestra (µl) ⎯ ⎯ ⎯ ⎯ ⎯ ⎯ ⎯ 23 µL 7µL

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Sección 2. ESTRUCTURA Y PROPIEDADES DE PROTEÍNAS

Tabla 2.4. Preparación de muestras para su corrimiento electroforético.

Concentración µL para 35 µg de proteína (µg/µL)

22. De acuerdo a los resultados señalar el o los pasos de purificación en donde se produjo el mayor

enriquecimiento en la proteína de interés, la lactato deshidrogenasa. Cuestionario 1. Con la información de los pesos moleculares utilizados en la electroforesis determinar la zona en la que se espera se encuentre la lactato deshidrogenasa. 2. De acuerdo a la anterior información señale en la foto del gel en donde se localizaría la LDH. 3. En cuál de los pasos se obtuvo una mayor cantidad de LDH. 4. Cuál de los dos métodos de purificación cromatográfica produce una mayor cantidad de LDH, la cromatografía de afinidad o la de intercambio iónico. 5. Usualmente, en una purificación se utilizan la cromatografía de intercambio iónico y la de afinidad como pasos secuenciales, una después de otra, pero por costos hemos utilizado sólo una de ellas. Predice con los resultados que obtuvo tú equipo y los otros equipos cuál sería el resultado si primero realizan la cromatografía de intercambio catiónico y luego la de cromatografía de afinidad. 6. Calcula el rendimiento proteico en cada uno de los pasos de la purificación. 7. ¿Qué cantidad de proteína se obtuvo al final? 8. ¿Cuántos contaminantes se tienen en la mezcla de proteínas final? 9. Elabora un esquema de purificación para la proteína malato sintasa, utilizando semillas de girasol. Recuerda que debes seguir la guía o protocolo de purificación de proteínas, preguntándote para que se utilizaría la proteína, en que material biológico se encuentra, en que compartimento celular, que tipo de proteína es funcionalmente (estructural, enzima, etc.). Referencias • Bradley JSCO, Markwell J. 2007. Assay for determination of protein concentration. Current protocols in protein science 3.4.1-3.4.29. • Devlin TM. Textbook of biochemistry with clinical correlations. Cuarta edición. 1997. John Wiley & Sons Inc, New York, USA. Pp 69-85. Localización QP514.T4 • Reiner W. 2005. Gel electrophoresis. John Wiley & sons, Ltd. www.els.net • Voet D, Voet JG. Biochemistry. Segunda edición. 1995. John Wiley & Sons Inc, New York, USA. Pp 71-104

0 1 2 3 4 FPA FPB Estándar

Adición de muestras y corrida 16. Aplicar las muestras en los pozos del gel concentrador en el siguiente orden en el que se obtuvieron las fracción y al final el estándar, PREGUNTAR A SU PROFESOR LOS PESOS MOLECULARES DE LOS ESTÁNDARES (Figura 2.6).

Figura 2.6 Aplicación de las muestras en los carriles de un gel de poliacrilamida-SDS.

17. Iniciar la electroforesis de 10 a 15 mA hasta que el frente haya entrado en el gel separador. Después incrementar el amperaje a 25 mA, siempre y cuando no se caliente el gel. 18. Terminar la corrida una vez que el frente haya alcanzado el borde inferior del el o según se desee. 19. Enseguida el gel se desprende de las placas y se realiza la tinción depositando el gel en una charola que contenga solución teñidora y colocando la bandeja en agitación constante. 20. Decantar la solución teñidora, lavar el exceso con H2O destilada y añadir la solución desteñidora. Poner a agitar suavemente. 21. Tomar una foto al gel teñido. 21

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0141BIOQUÍMICA EXPERIMENTAL Notas y Cálculos.

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