ÁREA DE LA SALUD HUMANA

UNIVERSIDAD NACIONAL DE LOJA

ÁREA DE LA SALUD HUMANA

CARRERA DE MEDICIANA

GUIA DE PRÁCTICAS EN EL LABORATORIO CON SUPERVISIÓN DOCENTE

• UNIDAD: Microbiología

• DOCENTE: Dr. Tito Goberth Carrión Dávila

• PRÁCTICA NÚMERO: Dos

• TEMA: Técnicas de Coloración

• OBJETIVOS:

-Conocer las técnicas de coloración de Gram y Zielh Neelsen.

-Describir el fundamento de la coloración Gram y Zielh Neelsen.

-Establecer los colorantes utilizados en cada una de las técnicas.

-Realizar el procedimiento de dichas coloraciones.

• FUNDAMENTO TEÓRICO DE LA PRÁCTICA A EJECUTAR:

El fundamento de las distintas coloraciones de las bacterias en general se basa en la diferencia estructural de la pared, así: En la coloración de Gram, la estructura que cobra importancia en la retención de la violeta de Genciana y el Yoduro de potasio es el peptidoglicano o mureina, mucho más desarrollado en la pared de las bacterias Gram positivas.

En la coloración de Zielh Neelsen o Alcohol Acido Resistente, se fundamenta en la presencia de un alto contenido de lípidos y ácidos micòlicos en la pared de las mycobacterias.

• TÉCNICAS Y PROCEDIMIENTOS PARA EJECUTAR LA PRÁCTICA:

Previamente a la realización de las diferentes técnicas de coloración se procederá a realizar el frotis de las diferentes muestras, sean estos sólidos o líquidos sobre un portaobjetos, se dejará secar y fijar mediante el calor, e inmediatamente se efectuará las técnicas de coloración.

Gram

Sobre el frotis seco y fijado al calor se coloca:

1. Violeta de Genciana, con lo cual se debe cubrir toda la extensión del frotis, por el lapso de 1 minuto.

2. Se lava con agua de la llave o con un dispensador de plástico con agua destilada.

3. Se coloca yoduro de potasio por el laso de 1 minuto.

4. Se lava.

5. Se le coloca fucsina fenicada o safranina por el tiempo de 15 segundos.

6. Se lava y se seca.

7. La placa está lista para ser observada al microscopio, con el lente de 100x o de inmersión.

Zielh Neelsen o B.A.A.R. o Baciloscopia

Sobre el frotis seco y fijado al calor se coloca:

1. Fucsina fenicada, por el tiempo de 5 minutos, mientras se calienta la placa con la lámpara de alcohol o mechero de bunsen, hasta que emita vapor.

2. Se lava con agua destilada o bien agua de llave, cuidando que el chorro no coincida directamente sobre el frotis, por el riesgo que se desprenda el material biológico.

3. El decolorante Alcohol-Acido, por dos minutos.

4. Lavar de la misma manera del paso dos.

5. Azul de Metileno, por el tiempo de 2 minutos.

6. Lavar similar al paso dos y dejar secar.

7. La placa esta lista para ser observado al microscopio, con el lente de 100x o de inmersión.

• RECURSOS DIDÁCTICOS:

En cada una de las técnicas de coloración se realizará una exposición introductoria del docente e inmediatamente se hará la demostración práctica.

Se utilizará materiales como dispositivos para la decoloración, pipetas, puntas, lámpara de alcohol, relojes, colorantes de agua destilada.

• RESULTADOS DE APRENDIZAJE: Los estudiantes:

-Conocen las técnicas de coloración de Gram y Zielh Neelsen.

-Describen el fundamento de la colaboración Gram y Zielh Neelsen.

-Establecen los colorantes utilizados en cada una de las técnicas.

-Realizan el procedimiento de dichas coloraciones.

• BIBLIOGRAFÍA:

• FORBES, B; SAHM. D.: Diagnóstico Microbiológico, 11a edición, Editorial Médica Panamericana, Buenos Aires, 2004, pág. 1115.

• VULLO, D.; WACHSMAN, M. Y ALCHE, L: Microbiología Médica: Manual de Técnicas de Laboratorio para la Enseñanza de Microbiología Básica Aplicada, Ed. Atlante s.r.L, Buenos Aires, 2000, pág. 261.

• ORGANIZACIÒN PANAMERICANA DE LA SALU-OPS: Manual de Técnicas para un Laboratorio de Salud, publicación científica Nº 439, Washington, pág. 487, 1993.

• PREGUNTAS A RESOLVER

¿Por su forma y coloración las bacterias se clasifican en?

Según su forma las bacterias se han clasificado en: cocos, bacilos, espirilos y espiroquetas, mientras que el método de identificación de las bacterias es la Tinción diferencial de Gram que permite identificar la morfología de la célula bacteriana en cocos y bacilos Gram positivos y Gram negativos según la estructura de su pared celular.

Se puede discriminar entre dos grandes grupos de bacterias: Gram positivas las misma que se tiñen de color violeta y las Gram negativas las cuales se tiñen de color rosado, lo cual es debido a las diferencias en la composición de su pared celular.

¿Cuáles son los principales características de las bacterias Gram positivas y Gram negativas?

Las Bacterias Gram Positivas a aquellas bacterias que se tiñen de azul oscuro o violeta por la tinción de Gram: de aquí el nombre de "Gram-positivas". La envoltura celular de las bacterias Gram-positivas comprende la membrana citoplasmática y una pared celular compuesta por una gruesa capa de peptidoglicano, que rodea a la anterior, dicha capa confiere una gran resistencia a estas bacterias y es la responsable de retener el tinte durante la tinción de Gram. A diferencia de las Gram-negativas, las Gram-positivas no presentan una segunda membrana lipídica externa a la pared celular y esta pared es mucho más gruesa.

Las siguientes características están presentes generalmente en una bacteria Gram-positiva:

• Membrana citoplasmática.

• Capa gruesa de peptidoglicano.

• Ácidos teicoicos y lipoteicoicos, que sirven como agentes quelantes y en ciertos tipos de adherencia.

• Polisacáridos de la cápsula.

• Si algún flagelo está presente, este contiene dos anillos como soporte en oposición a los cuatro que existen en bacterias Gram-negativas porque las bacterias Gram-positivas tienen solamente una capa membranal.

Bacterias Gram Negativas son aquellas bacterias que no se tiñen de azul oscuro o violeta por la tinción de Gram, y lo hacen de un color rosado tenue: de ahí el nombre de "Gram-negativas"

Las bacterias Gram-negativas presentan dos membranas lipídicas entre las que se localiza una fina pared celular de peptidoglicano, mientras que las bacterias Gram-positivas presentan sólo una membrana lipídica y la pared de peptidoglicano es mucho más gruesa. Al ser la pared fina, no retiene el colorante durante la tinción de Gram.

Muchas especies de bacterias Gram-negativas

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