Determinación cuantitativa de proteína por metodos espectrofotometricos
Enviado por Jason Daniel Villalobos Ardila • 13 de Abril de 2023 • Informes • 1.783 Palabras (8 Páginas) • 40 Visitas
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Bioquímica
Informe de laboratorio
Práctica N. 6
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DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE PROTEÍNA POR METODOS ESPECTROFOTOMETRICOS
Acho Orozco Brayan Giovanni[1], Torres Marulanda Diego Fernando[2], Fitatá Castaño Joan Sebastián[3]
Resumen (summary).
La espectrofotometría es un método de análisis cuantitativo-químico que usa la luz (absorbida por un sistema) para poder determinar la concentración de una sustancia. La parte de una molécula responsable de la absorción de la luz se llama cromóforo. Toda sustancia que absorbe luz visible aparece coloreada cuando transmite o refleja la luz. Cuando la radiación pasa a través de la solución se eliminan determinadas frecuencias por absorción. La absorción promueve a estas partículas de su estado elemental a uno o más estados de excitación de energía más elevada. La energía del fotón excitante debe coincidir con la diferencia de energía de especies absorbentes. Lo cual brinda información cualitativa y la intensidad de esa absorción información cuantitativa. En otras palabras, algunas moléculas son capaces de absorber (sólo ciertas longitudes de onda) y aquellas que no lo son determinan el color que nuestros ojos pueden detectar. La espectrofotometría utiliza dicha propiedad para identificar y cuantificar estas moléculas. Con base en lo anterior, el objetivo de la práctica consistió en determinar cuantitativamente proteínas mediante la técnica de espectrofotometría.
Spectrophotometry is a method of quantitative-chemical analysis that uses light (absorbed by a system) to determine the concentration of a substance. The part of a molecule responsible for absorbing light is called a chromophore. Any substance that absorbs visible light appears colored when it transmits or reflects light. When radiation passes through the solution certain frequencies are eliminated by absorption. Absorption promotes these particles from their elementary state to one or more higher energy excited states. The energy of the exciting photon must match the energy difference of absorbing species. Which provides qualitative information and the intensity of that absorption quantitative information. In other words, some molecules are able to absorb (only certain wavelengths) and those that are not determine the color that our eyes can detect. Spectrophotometry uses this property to identify and quantify these molecules. Based on the above, the objective of the practice was to quantitatively determine proteins using the spectrophotometric technique.
Palabras clave (keywords).
Espectrofotometría, cuantitativo, absorción, energía, proteínas.
Spectrophotometry, quantitative, absorption, energy, proteins.
Objetivos.
- Cuantificar la cantidad de proteína en una muestra, usando correctamente el espectrofotómetro, comprendiendo la relación entre absorbancia y concentración de soluto.
Marco teórico.
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Figura 1. Mapa conceptual sobre los aspectos relevantes de la espectrofotometría.
Metodología
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Figura 2. Diagramas de flujo del procedimiento en laboratorio.
Evidencias fotográficas del procedimiento
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Figura 3. Tubos de ensayo rotulados. Los tubos M1 y M2 fueron evaluados con una muestra problema. El tubo M1, con 0,7 ml y 0,3ml de solución problema y el tubo M2, con 0,5 ml de agua 0,5ml de solución problema.
De acuerdo con la información consignada en la Tabla. 1. Fue llenado cada uno de los 8 tubos de ensayo (Fig. 3). El reactivo C se preparó con los reactivos A (NaCO3 2%), B1 (CuSO4*5H20 al 1%), Y B2 (tartrato sódico –potásico 2%) en las siguientes cantidades: Reactivo A: 50 ml, reactivo B1: 0,5ml, reactivo B2: 0,5ml. Una vez homogenizadas las soluciones, la mezcla tomó una coloración azul claro (Fig. 5).
Tabla 1. Proporciones volumétricas para determinación espectrofotométrica.
TUBO | AGUA (ml) | ALBÚMINA (ml) | MUESTRA PROBLEMA (ml) | RACTIVO C (ml) | FOLLIN DILUIDO (ml) |
B | 1 | ------- | ------- | 5 | 0,5 |
1 | 0,9 | 0,1 | ------- | 5 | 0,5 |
2 | 0,8 | 0,2 | ------- | 5 | 0,5 |
3 | 0,7 | 0,3 | ------- | 5 | 0,5 |
4 | 0,6 | 0,4 | ------- | 5 | 0,5 |
5 | 0,5 | 0,5 | ------- | 5 | 0,5 |
M1 | 0,7 | ------- | 0,3 | 5 | 0,5 |
M2 | 0,5 | ------- | 0,5 | 5 | 0,5 |
La ley de Lambert-Beer, aplicada desde la óptica, refiere la capacidad de absorción de la luz con las propiedades del material atravesado (Fig. 4). En este sentido, relaciona la intensidad de la luz entrante con la luz saliente después de producirse la absorción (Mäntele & Deniz, 2017).
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Figura 4. Comportamiento de un haz incidente sobre una celda.
La medición de absorbancia debe realizarse mediante una celda espectrofotométrica trasparente, la cual debe contener la solución del analito. La atenuación del haz resultante es de carácter sustancial. Además, la atenuación de un determinado haz, puede ocurrir por dispersión de las moléculas grandes y en algunos casos particulares por absorción de las paredes del recipiente (Skoog et al., 2008).
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