RESUMENES

Introducción

La electroforesis de campos pulsados es una técnica utilizada para la separación de DNA cromosómico, alternando los campos eléctricos entre pares de electrodos en diferentes espacios, provocando su reorientación en los pozos del gel.

Material requerido

Reactivos (temperatura de almacenamiento)

• Agua grado biología molecular TA (temperatura ambiente).

Material de plástico y desechables

• Puntas para micropipetas con filtro de 1,000 l, 100 l y 10l.

• Tubos de polipropileno de 1.5 ml.

• Tubos de polipropileno de 50 mL.

• Tubos de polipropileno de 15 mL

• Guantes de nitrilo

• Plumones indelebles de punto fino.

• Recipiente para desechos.

• Etiquetas autoadheribles

Equipo

• Microcentrifuga para tubos de 1.5 ml.

• Micropipetas para volúmenes de 1,000 l, 100 l y 10l.

• Vortex

• Gradilla para microtubos de 1.5 ml y 0.2 l.

• Baños o incubadora con agitación a 54° y 55-60°C.

Medidas generales

• Usar bata de laboratorio y guantes limpios mientras se preparan la muestras

• Cambiar los guantes siempre que se sospeche que están contaminados.

• Mantener las reacciones y componente cubiertos tanto como sea posible.

• Limpie las mesas de laboratorio y el quipo periódicamente con solución de cloro al 10%.

PROCEDIMIENTO

Para el procedimiento completo, se requiere ocho días de trabajo, desde el cultivo del microorganismo hasta el análisis de los patrones de restricción.

DÍA 1

Sembrar los aislamientos a evaluar en placa de agar Bordet-Gengou o agar charcoal durante dos días a 35°C.

DÍA 2

Verificar el crecimiento de las placas.

DÍA 3

Preparación de la suspensión bacteriana

1. Del cultivo anterior, se toman colonias de B. pertussis y se resuspender en un mililitro de amortiguador TE1X (10mM Tris, 1mM EDTA a pH de 8) en un microtubo de 1.5 mL previamente etiquetado.

2. Obtener una suspensión bacteriana que contenga 109UFC/ml. Centrifugue a 10,000rpm durante 2 min. Retirar el sobrenadante y con ayuda de vortex, resuspender el precipitado.

3. Agregar 150 µL de amortiguador TE1X. Mantener en incubación a 50°C por 10min.

Preparación de bloques de agarosa

1 Incubar la agarosa al D1 al 1% sin sarcosil (Agarosa en TBE 0.5X) a 55°C.

2 Preparar los moldes por duplicado con ayuda de una cinta masking/diurex, colocando un pedazo de cinta para hacer el fondo. Para facilitar la manipulación, marcar el extremo donde se colocara la primera muestra.

3 Agregar 150 µL de agarosa al 1% a cada tubo que contiene la suspensión bacteriana, mezclar de 10 a 15 veces con ayuda de la micropipeta.

4 Tomar de la mezcla anterior 100-150 µL hasta llenar los moldes para bloques, dejando un pequeño menisco en cada bloque.

5 Permitir gelificar en hielo durante 20 min hasta que se solidifiquen o a temperatura ambiente.

Lisis de células en los bloques de agarosa

1. Preparar el amortiguador de lisis (EDTA 0,5 M, sarcosil al 1% y 0,5 mg de proteinasa K a pH 8)

2. Etiquetar tubos de 1.5 mL por cada una de las muestras y adicionar 25 μL de proteinasa K (20 mg/mL)

3. Colocar 1000 μL de amortiguador de lisis (EDTA 0,5 M, sarcosil al 1% y 0,5 mg de proteinasa K a pH 8) a cada microtubo.

4. Con ayuda de un broche Baco, transferir los bloques de agarosa del molde y colocarlos en el tubo correspondiente.

5. Incubar los bloques a 50°C por 24hrs.

DÍA 4

Lavado de los bloques de agarosa después de la lisis.

1. Etiquete un tubo de centrífuga de 50 mL por cada uno de los aislamientos.

2. Coloque 10 mL de amortiguador TE 1 X a pH de 8.

3. Con ayuda de un broche baco coloque los bloques en el tubo de 50 mL

4. Incube a 37ºC durante 30 min con agitación o a 50ºC durante 15 min, esta última incubación puede provocar que los bloque se rompan.

5. Coloque la tapa para filtrar y eliminar el amortiguador TE 1 X, elimine el amortiguador.

6. Posteriormente se añaden 30 ml de amortiguador TE 1X y 690 µl de la solución de PMSF 0.1M en etanol y la mezcla se incuba durante 1 h a 55°C.

7. Posteriormente los tubos se deberán enfriar en hielo o a temperatura ambiente.

8. Lavar con 10 ml de amortiguador TE 1X a pH 8.

9. Los bloques se pueden almacenar en EDTA 0,5 M a pH 8 (1 ml por bloque). Los bloques pueden mantenerse a 4°C en esta solución.

DÍA 5

Digestión de bloques de DNA por restricción con la enzima XbaI

Se puede digerir una porción del bloque de agarosa o del bloque completo. Se sugiere lo primero ya que utiliza menos cantidad de enzima.

1. Etiquetar un tubo falcón de 50 mL por cada bloque de agarosa. Adicionar 40 ml de TE 1X a pH 8.

2. Se decanta la solución de EDTA 0.5M o en su caso del amortiguador.

3. Con ayuda de un broche Baco se transfiere un bloque de agarosa a cada tubo Falcón correspondiente. El tubo se deja a 4°C durante 4 h en agitación ocasional.

4. Etiquetar dos tubos de microcentrifuga por cada aislamiento a probar.

5. El tubo 1 se colocara los bloques sobrantes.

6. El tubo 2 se utilizara para incubar con la enzima.

7. Con ayuda de un broche, el bloque se corta en dos partes.

8. Una porción del bloque cortado, se coloca en un microtubo con 200 µl de la mezcla de reacción que contiene 20 U de XbaI. Se incuba durante toda la noche a 37°C. el resto de los bloques, se coloca en el primer microtubo con EDTA 0,5 M a pH 8 o TE 1X a pH 8.

9. La reacción se detiene agregando 500 μL de TE 1X. El DNA cortado puede mantenerse durante varias semanas a 4°C. Debe tenerse en cuenta que los fragmentos de menos de 30 kpb se pueden difundir fuera del bloque, por lo que el almacenamiento de los bloques no se recomienda

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