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Aminoácido alfa-amino terminal de las cadenas de la molécula de hemoglobina mediante el método de Sanger


Enviado por   •  2 de Noviembre de 2015  •  Práctica o problema  •  747 Palabras (3 Páginas)  •  1.001 Visitas

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Objetivos

Identificar el aminoácido alfa-amino terminal de las cadenas de la molécula de hemoglobina mediante el método de Sanger

Introducción

El método de 1-fluoro-2,4,dinitrobenceno (DNFB) para la determinación en péptidos y proteínas de los aminoácidos con el grupo alfa amino libre fue introducido por F. Sanger La determinación cosnsite en la dinitrofnilación del aminoácido N-terminal de la proteína, la eliminación del DNFB que no reaccionó, hidrólisis de la DNP-proteína y de la identificación del residuo N-terminal por cromatografía en papel.

¿Qué hicimos?

¿Para qué?

Hemolobina+Bicarbonato de Sodio+DNFB

Para que reactivo de DNFB reaccione con la proteína, se tiene que llevar a cabo en condiciones alcalinas

Agreamos HCl  al 3 N

Para detener la reacción

Agregamos éter saturado con solución acusosa de FeSO4

Para obtener la fase acuosa de la solución

Colocar en la proteína dinitrofenilada en baño maria y agitar

Para eliminar cualquier residuo de la fase etérea que pudo haber quedado

Centrifugamos a 3000rpm a 15 minutos

Para eliminar el sobrenadante

Añadimos HCl al 6N

Para que la proteína se hidrolizara en condiciones ácidas.

Después se calentó en autoclave a 3 horas y 15 libras

Para que la hidrolisis se llevara a cabo se necesitaban de éstas condiciones de temperatura y presión

Agregamos éter saturado, en 3 porciones

Para obtener el hidrolizado

En papel Whatman, se realizó una cormatografía en papel

Para la identificación del residuo N-terminal de la hemoglobina

Utilizando ácido cítrico, citrato de sodio

Como solvente

Se colocó dicho cromatograma, en una cámara previamente saturada con el solvente

Se realzó el mismo procedimiento de cromatografía para DNP-phe, DNP-Asp. Dnp-Val

Para comparar los resultados obtenidos de Rf, para cada aminoácido

Después de 5 horas, sacamos los cromatogramas de la cámara, y se marcó el frente del solvente

Para obtener los datos necesarios para realizar los cálculos de rRf

Por dicha cromatografía se identificó el residuo N-terminal de la proteína hemoglobina

Que en este caso el más cercano es el de la valina , debido a que el Rf DNP-val fue de 0.88 y el de nuestro problema se obtuvo de Rf problema= 0.84

Resultados:

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Fig 1. Representación del cromatograma realizado en la práctica

  • Distancia recorrida de  la fase móvil: 32 cm (Fd)
  • Distancia recorrida del problema: 26.9

Fórmula

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Compuesto

Fs

Rf

DNP- Phe

24 cm

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DNP- Val

28.3 cm

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DNP-Ala

24.5 cm

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DNF

19 cm

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Problema

26.9 cm

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  Análisis de resultados:

Mediante el método de Sanger se determinó experimentalmente el grupo amino libre de la molécula hemoglobina  mediante una cromatografía en papel para su identificación con aminoácidos dinitrofenilados como referencia junto con nuestro producto hidrolizado, de acuerdo con la bibliografía la hemoglobina está conformada por cuatro polipéptidos: dos cadenas alfa y dos cadenas beta. Cada cadena alfa está constituida por 141 aminoácidos  y la valina es el aminoácido  con el grupo alfa amino libre, es decir el amino terminal y la cadena beta contiene 146 aminoácidos también con la valina con el el grupo alfa amino libre………………..(3)

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