Extracción y cuantificación de DNA en gel de agarosa

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL[pic 1][pic 2]

UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA

DE INGENIERÍA CAMPUS GUANAJUATO

UA: LABORATORIO DE BIOTECNOLOGÍA MOLECULAR

GRUPO: 5BM1

PRÁCTICA 1: EXTRACCIÓN DE DNA DE BACTERIAS

PRÁCTICA 2: CUANTIFICACIÓN DE DNA Y VISUALIZACIÓN EN GEL DE AGAROSA

EQUIPO 4

HERNÁNDEZ PÉREZ BRENDA VALERIA

LOZORNIO CERVANTES CARLOS ALBERTO

MARTÍNEZ LÓPEZ ÁNGELES BERENICE

PIÑÓN RODRÍGUEZ ANA CECILIA

SÁNCHEZ TAPIA ALAN ISAY

VEGA HERNÁNDEZ ISAÍ

DOCENTES

CÉSAR AZA GONZÁLEZ

ESTEFANY ABIGAIL GARDUÑO  

SILAO DE LA VICTORIA

FECHA: 2 DE SEPTIEMBRE DE 2022

Resultados

P1. EXTRACCIÓN DE DNA DE BACTERIAS

Se usó una cepa de E. Coli en 10 mL de medio LB, para extraer DNA genómico. El proceso de extracción se hizo además de manera no estéril, exceptuando la inoculación de la cepa en el medio LB.

Las muestras fueron inoculadas un día antes de la práctica e incubadas a 37°C con una agitación de 200 rpm, con el fin de cultivar la cepa aproximadamente 18 horas. El color de la muestra era de un color ámbar con una turbidez notable. Después las muestras fueron guardadas en la incubadora, para su uso posterior el día de la práctica (Figura 1).

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Figura 1. Tubos Falcon que contienen cepas de E. Coli inoculadas en medio LB, guardadas en la incubadora.

El medio se centrifugó a 3500 rpm, por 8 minutos a 15°C, logrando separar una pastilla blanca grisácea, donde se podía apreciar estaba pegada a un costado del tubo Falcon, el medio siguió conservando el color ámbar del medio LB como se muestra en la Figura 2.

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Figura 2. Pastilla bacteriana encerrada en un círculo rojo, separada del medio LB en un borde del tubo Falcon.

Tirando el sobrenadante, se agregó buffer TE (570 μL) y se resuspendió, para luego pasar la mezcla a un tubo de microcentrífuga. La coloración de la mezcla se volvió de un color café claro, presentando una turbidez general en la misma, y se pudo observar una espuma de color blanco en la parte superior del tubo (Figura 3 y 4).

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Figura 3. Muestra con buffer TE en un tubo de microcentrífuga vista desde atrás.

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Figura 4. Muestra con buffer TE en un tubo de microcentrífuga vista desde el frente.

Después de agregar todas las diversas soluciones, centrifugar, incubar y realizar la mayoría de la metodología correspondiente a la sesión 1, no se pudo apreciar la formación de hebras de pequeño tamaño del DNA precipitado. Lamentablemente debido a que la práctica se extendió más de lo esperado ningún integrante del equipo pudo quedarse a realizar los últimos pasos, por lo tanto, se le delegó a una integrante de otro equipo por lo cual no se pudo tomar una foto o evidencia de la no aparición de las hebras en el tubo obtenido.

Al comenzar la segunda sesión, se sacó del refrigerador el tubo con la pastilla de DNA, en el cual se podía apreciar en el fondo de este la pastilla de color blanco pegada a un lateral del tubo (Figura 5).

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Figura 5. Pastilla de DNA de E. Coli precipitada en el fondo de tubo de microcentrífuga.

Después de sacarla de refrigeración se centrifugó y en el primer intento al correr alrededor de 2 minutos la centrífuga, la misma estaba a 0°C, por lo tanto, se paró y se configuró nuevamente a 4°C para que las condiciones de la centrifugación fueran las correctas.

Ya llegando al final de la segunda sesión, se incubó colocando el tubo abierto en una gradilla para secar la pastilla en el horno por 10 minutos a 50°C, y al sacar el tubo de la gradilla, la pastilla no era fácil de ver en el tubo, apenas y se podía apreciar una mancha muy pequeña en el fondo de este. Después el tubo con la pastilla suspendida en TE se guardó en el refrigerador para su posterior cuantificación en la siguiente práctica (Figura 6).

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Figura 6. Tubo de microcentrífuga en donde es difícil apreciar a simple vista la formación final de la pastilla.

P2. CUANTIFICACIÓN DE DNA Y VISUALIZACIÓN EN GEL DE AGAROSA

Electroforesis de la muestra en gel de agarosa

Después de agregar las muestras a cada pozo, se asignó un pozo para colocar marcador de tamaño molecular (la cantidad a adicionar dependerá de la casa comercial del producto). Se utilizó el marcador 1kb plus DNA Ladder invitrogen 10787-018.

La distribución en la cámara de electroforesis se muestra en la Figura 7.

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Figura 7. Distribución en cámara de electroforesis para colocación de muestra por equipo. Los pozos color verde contenían muestra con el marcador cyan-orange buffer y los de color azul contenían muestra con …..

Se conectó la fuente proveedora y se corrió a 100V y 500mA, por 45 minutos, pasado ese tiempo se visualizó el gel en el transiluminador, y se observó la migración de las moléculas de DNA hacia el electrodo positivo, como se muestra en la Figura 2, pudiéndose observar ADN en una forma rectangular con un brillo no muy intenso y en la parte inferior se puede observar lo que fue el marcador cyan-orange.

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Figura 8. Fotografía obtenida en el transiluminador: Migración de moléculas de DNA bajo la influencia de un campo eléctrico.

El DNA degradado se muestra como un barrido en el carril de cada muestra; así mismo, se observan carriles donde las moléculas de DNA son tan grandes que no se rompieron y se ubican totalmente en la parte inferior sin degradar. Las muestras correspondientes a nuestro equipo se muestran en la Figura 9 de una manera más detallada.

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Figura 9. Fotografía obtenida en el transiluminador: Migración de moléculas de DNA bajo la influencia de un campo eléctrico de Equipo 4 (mostradas en el óvalo rojo), del lado derecho se observa el carril del marcador de peso molecular 1kb plus DNA Ladder invitrogen 10787-018.

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