IBMC- PREPARACIÓN DNA PLASMÍDICO

TRABAJO PRÁCTICO 2

PREPARACIÓN DE DNA PLASMÍDICO

DE Esterichia coli

GRUPO 8:

INTRODUCCIÓN

Los plásmidos son moléculas de DNA circular que se encuentran en bacterias, como Escherichia coli y también en algunas células eucariotas. No son esenciales para la vida de la bacteria, sin embargo, llevan información genética importante, que les permiten sobrevivir en condiciones desfavorables, o competir con otros microorganismos en el mismo nicho ecológico. Algunos ejemplos:

• Interacciones simbióticas y fijación de nitrógeno en bacterias del género Rhizobium.

• Resistencia a antibióticos (plásmidos R), metales pesados (mercurio).

• Plásmidos de virulencia: producen toxinas, factores de penetración de tejidos, adherencia en los tejidos del hospedador.

• Inducción de tumores en plantas dicotiledóneas.

• Producción de bacteriocinas ( proteínas tóxicas producidas por bacterias que eliminan a otras de la misma especie).

• Producción de sideróforos (quelatos capaces de incorporar iones Fe3+.

• Utilización de determinados azúcares.

• Utilización de hidrocarburos (degradación de tolueno, xileno, alcanfor) en Pseudomonas.

Diferentes plásmidos pueden coexistir en una célula, aunque durante la división celular, las moléculas de DNA plasmídico segregan al azar sus células hijas, por lo que, a lo largo de varias generaciones, el plásmido podría perderse. En ausencia de una presión selectiva, los plásmidos compiten dentro de la célula, y al cabo de varias generaciones, uno de ellos permanecerá dentro de la célula, mientras que el otro será excluido, a esto se lo conoce como incompatibilidad plasmídica (solo ocurre cuando los plásmidos tienen el mismo mecanismo de control de número de copias, ORI) . Sus aplicaciones en la Biología Molecular y Celular son diversas, por ejemplo en terapia génica, vectores de clonado, vectores de expresión (los vectores son plásmidos, que permiten insertar genes foráneos en el núcleo de una célula).

En los vectores de clonado se incorpora una secuencia de DNA genómico (cDNA) que se quiere clonar y amplificar en las bacterias. Estas bacterias se transforman con el plásmido/vector y se plaquean en un medio sólido, para que puedan formar colonias. Estas colonias serán provenientes de una única bacteria que haya incorporado un único plásmido (clon). Si el plásmido tiene un ORI de “alto número de copias”, al amplificar el clon se logra amplificar el inserto como consecuencia de la multiplicación del plásmido.

En los vectores de expresión, además de colocar el inserto (cDNA) se colocan secuencias regulatorias y/o promotores para controlar la expresión (trascripción y traducción) del gen codificado por el inserto. Con esto se puede expresar la proteína para estudiar su función o purificarla, también se puede estudiar la regulación de su expresión.

Elementos más importantes del plásmido pBluescript II KS/SK (+)

-ORI o rep (Pmbi): es el orígen de replicación de alto número de copias.

-Gen bla (ApR) de resistencia a antibióticos (amplicilina): codifica para la β-lactamasa, que es una enzima que degrada a la amplicilina y le permite a la bacteria sobrevivir en un medio que contiene este antibiótico.

-Polylinker o sitio múltiple de clonado (MCS): contiene secuencias únicas de reconocimiento para varias enzimas de restricción.

-Promotores PT3 y PT7: en presencia de RNA pol de los bacteriófagos T3 y T7, se puede dirigir la transcripción del inserto en uno u otro sentido.

-Lac Z: codifica para la enzima β-galactosidasa, la cual degrada a la lactosa.

-F1: origen de replicación viral para obtener DNA de cadena simple.

OBJETIVO

Se procederá a extraer DNA plasmídico, mediante la utilización de diferentes soluciones:

Solución 1 (resuspención) contiene:

-Tris-HCL: es un buffer que mantiene el pH constante (pH=8).

-EDTA: inhibe la acción de las nucleasas que degradan al DNA, ya que captura cationes divalentes Ca2+ o Mg2+.

Solución 2 (lisis alcalina) contiene:

-SDS: solubiliza los fosfolípidos de las menmbranas y permite acceder al DNA, desnaturaliza proteínas.

-NaOH: aumenta el pH de la solución y desnaturaliza proteínas, DNA genómico y plasmídico y desestabiliza moléculas de RNA.

Solución 3 (renaturalización) contiene: K+ Ac O- 3M pH 4.8.

Se renaturaliza en DNA plasmídico y se separa el DNA genómico.

Isopropanol: permite que precipite el DNA plasmídico.

Etanol 70%: se utiliza para lavar el pellet y eliminar sales y otros compuestos polares.

RNasa: Degrada el RNA que copurifica con el DNA plasmídico.

MATERIALES

• Un tubo eppendorff con pellet correspondiente a 1,5 ml de cultivo bacteriano en fase estacionaria de una cepa de Esterichia coli conteniendo un plásmido con alto número de copias, resuspendido en 0,3 ml de la solución 1.

• 0,3 ml de solución 2.

• 0,3 ml de solución 3.

• Isopropanol.

• Etanol 70%

• Tubos eppendorff vacíos en una gradilla.

• Recipiente con hielo

• 20 μl de agua MilliQ con RNasas para algunos grupos o sin RNasas para otros grupos.

DESARROLLO

La solución 1 fue agregada con el fin de desestabilizar la membrana de las bacterias. La solución 1 es hipotónica respecto al citoplasma, el agua tiende a entrar a la bacteria y la presión ejercida colabora con la desorganización de la membrana.

Luego se incorporaron 0,3 ml de solución 2 para lograr el lisado de las bacterias. Esta solución está compuesta por: SDS, que solubiliza los lípidos de la membrana. La solución 2 también está formada por NaOH (pH alto), que actúa desnaturalizando el DNA plasmídico y cromosómico, proteínas y parte del RNA. En el preparado, luego de este paso, se observó un aspecto viscoso, debido a la ruptura de las bacterias y a la salida del DNA de la misma.

Luego se incorporaron 0,3 ml de la solución 3 y se mezcló por inversión. Esta solución (pH bajo) permite la renaturalización del DNA y la neutralización del pH proveniente del paso anterior. Existe una diferencia entre los dos tipos de DNA; el DNA plasmídico renaturaliza totalmente, mientras que el cromosómico solo lo hace de forma parcial, debido a la diferencia de tamaños. El cambio de pH y la incorporación del acetato, favorecen la insolubilidad del detergente (SDS) y hacen precipitar al DNA cromosómico y no al plasmídico. Esto además se ve favorecido por trabajar en hielo, ya que las bajas temperaturas permiten la renaturalización.

Luego de la centrifugación de 15 minutos, se separó el sobrenadante que contenía el ADN plasmídico, ADN cromosómico, proteínas y demás, del pellet, que fue descartado. El agregado de isopropanol (hasta llenar el tubo, 0,6-0,7 ml) a temperatura ambiente permite la disminución de la polaridad, ya que es menos polar que el agua y así, el DNA precipita.

Se centrifugó durante 30 minutos para descartar las sustancias indeseadas, siendo esta vez el pellet de nuestro interés y el sobrenadante descartado. Luego de esto, se le agregaron 500 μl de etanol 70% para eliminar las sales y despegar el pellet. Se volvió a centrifugar nuevamente durante 5 minutos. El último paso fue dejar secar el contenido del tubo eppendorf para eliminar el etanol restante mediante la evaporación del mismo.

Luego del secado del pellet, algunos grupos incorporaron 20 μl de agua MilliQ conteniendo RNasas (este fue el caso de nuestro grupo) y otros incorporaron 20 μl de agua MilliQ sin RNasas.

Se guardaron los tubos eppenderff a -20°C.

Las conclusiones de este trabajo se verán en los próximos trabajos prácticos, ya que se utilizará el ADN plasmídico obtenido.

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