LA nueva Importancia de la microbiología

Tipo de tinción

Principio

Fundamento teórico

Diagnostico microscópico

Procedimiento

Tinción de Gram

Es de carácter diferencial que utiliza el cristal violeta como colorante primario, el lugol como mordente, una mezcla etanol- agua como  agente decolorante y safranina como colorante contrarrestaste.

Esta técnica fue desarrollada en 1884 por un médico llamado Christian Gram. Es una de las tinciones más utilizadas que separa las bacterias en las Gram-positivas y las Gram negativas. Fundamentada en la reacción de peptidoglucano de la pared celular de las bacterias Gram (+) al agente colorante, condesándose y constituyendo un obstáculo para la salida del complejo cristal- violeta-lugol. Por lo contario  las bacterias Gram (-) también poseen peptidoglucano pero en menor cantidad, dejando lugar para la safranina  

Las bacterias Gram positivas se observaran de color purpura y las Gram negativas se observaran de color rosado.

Las bacterias las podemos encontrar en forma de cocos y bacilos

• Preparación del frotis a partir de cultivo de medio sólido.

• Marcar los portaobjetos limpios y desgrasados en uno de sus extremos.
• Con el asa colocar una pequeña gota de agua en el centro.
• Mezclar homogéneamente la muestra con el agua.
• Fijar frotis con ayuda del mechero.

• Frotis a partir de cultivo en medio líquido.

•  Marcar en un extremo los portaobjetos limpios y desgrasados.
• Con el asa tomar una gota de cultivo en medio líquido y extenderla para formar una película delgada y uniforme.
• Dejar sacar al aire.
•  Fijar al color.

• Tinción simple de frotis.

• Colocar el frotis sobre un puente de coloración.
• Cubrir el frotis con el colorante, dejarlo durante 1 minuto.
• Escurrir el colorante.
• Enjuagar sobre el chorro suave de agua corriente.
• Dejar secar al aire.

• Tinción de Gram.

• Hacer frotis de cada uno de los cultivos, dejar secar al aire.
• Fijar el frotis al color.
• Cubrir el frotis con cristal violeta, dejarlos 1 min. Escurrir el colorante y lavar con agua.
• Cubrir el frotis con lugol, dejarlo 1 min, escurrir y lavar con agua.
• Decolorar el frotis con alcohol – acetona, de 5 a 15 seg. Escurrir y lavar con agua.
• Cubrir con safranina y dejarlo por 30 seg, escurrir y lavar con agua.
• Dejar secar el frotis al aire y observar con el objeto de inmersión.

Tinción para ácidos resistentes

(Técnica de Ziehl-Neelsen)

Esta tinción permite diferenciar a las bacterias en dos grupos: aquellos que son capaces de resistir la decoloración con alcohol-ácido y aquellos que no lo son.

El contenido de lípidos de la pared celular de los bacilos ácido-alcohol resistente dificulta la tinción de los organismos. En las tinciones ácido-alcohol resistentes, el fenol permite que la tinción penetre, incluso después de la exposición a los descolorantes. Para que un organismo se denomine ácido-alcohol resistente, debe resistir la descoloración por ácido-alcohol. Se usa entonces una contratinción para destacar el organismo teñido.

Las paredes celulares de ciertos parásitos y bacterias contienen ácidos grasos de cadena larga que les confieren la propiedad de resistir la decoloración con alcohol-ácido, después de la tinción con colorantes básicos, por esto se denominan Ácido-Alcohol Resistentes. Las micobacterias como M. tuberculosis y M. marinum y los parásitos coccídeos como Cryptosporidium se caracterizan por sus propiedades de ácido-alcohol resistencia. La coloración clásica de Ziehl-Neelsen requiere calentamiento para que el colorante atraviese la pared bacteriana que contiene ceras.

Los bacilos ácido-alcohol resistentes se tiñen de rojo, otros organismos se tiñen de azul o de verde dependiendo de la contratinción empleada.

• Prepare una extensión delgada y uniforme y deje secar al aire.
• Fije al calor y deje enfriar.
• Inunde la preparación con Carbol Fucsina ZN y caliente suavemente (no hierva). Deje que repose durante 10 minutos aplicando calor de nuevo después de 5 minutos.
• Enjuague con agua.
•  Inunde la preparación con Diferenciador durante 10 minutos, aplicando un cambio de Diferenciador a los 5 minutos.
•  Enjuague con agua.
• Inunde la preparación con contratincion (azul de metileno o verde malaquita), deje reposar durante 1 minuto.
• Enjuague bien con agua, seque suavemente con papel secante o seque usando calor suave.
•  Mire utilizando microscopia de inmersión en aceite.

Tinción para ácidos resistentes

(Técnica de Kinyoun)

El contenido de lípidos de la pared celular de los bacilos ácido-alcohol resistente dificulta la tinción de los organismos. En las tinciones ácido-alcohol resistentes, el fenol permite que la tinción penetre, incluso después de la exposición a los descolorantes. Para que un organismo se denomine ácido-alcohol resistente, debe resistir la descoloración por ácido-alcohol.

Se usa entonces una contratinción para destacar el organismo teñido.

Utiliza un reactivo especial que además de fucsina agrega una mayor concentración de Fenol. El fenol disuelve los lípidos de las paredes celulares permitiendo que el colorante primario entre el contacto con los ácidos carboxílicos y forme el complejo ácido-alcohol resistente. Esta técnica permite obtener resultados diferenciales ya que no es posible la decoloración en caliente.

Los bacilos ácido-alcohol resistentes se tiñen de rojo, otros organismos se tiñen de azul o de verde dependiendo de la contratinción empleada.

• Prepare una extensión delgada y uniforme y deje secar al aire.
•  Fije al calor y deje enfriar.
• Inunde la preparación con carbol fucsina Kinyoun, deje reposar durante 10 minutos.
• Enjuague con agua.
• Inunde la preparación con Diferenciador durante 10 minutos, aplicando un cambio de Diferenciador a los 5 minutos
• Enjuague con agua.
• Inunde la preparación con contratincion (azul de metileno o verde malaquita), deje reposar durante 1 minuto.
• Enjuague bien con agua, seque suavemente con papel secante o seque usando calor suave. 9. Mire utilizando microscopia de inmersión en aceite.

Tinción de capsula

(Método de la tinta china)

Este método es muy útil, aunque está limitado por la presencia de un fondo oscuro que no permitirá la correcta identificación de forma nítida y detallada de los componentes de dichas estructuras. algunas estructuras difundirán el colorante y otras no, lo que permitirá un contraste de las estructuras observadas

Es una técnica de microscopia que permite contrastar las muestras mediante una sustancia opaca a los fotones (microscopía óptica) o a los electrones (microscopía electrónica). Donde se emplea  tinta china; para el caso de bacterias que esporulan, esta técnica permite visualizar las esporas como entes refringentes sobre un campo de fondo oscuro.

Se puede observar la cápsula (es la capa que rodea la esfera).

• Colocar varias asadas de cultivo en un portaobjetos limpio, cerca de uno de los bordes.
• Colocar un volumen igual de tinta china cerca del cultivo.
• Mezclar bien con un asa y luego extender la mezcla a lo largo del portaobjetos, utilizando la técnica del frotis sanguíneo.
• Dejar que el frotis se seque.
• Observar al microscopio.

Tinción de capsula

(Método de Muir)

Tinción negativa que se basan en colorantes diferenciales cuando la cápsula toma un colorante y la bacteria otro

Para determinar la presencia de material capsular se hizo una tinción de cápsula según el método de Muir tal como describe Cowan & Steel’s (1993). La cápsula se tiñe con el mordiente de Muir mientras que las bacterias son contrastadas con una solución de fucsina. Esta tinción se ha practicado sobre los microorganismos desarrollados en TSA a 15 ºC durante 6 días

Las bacterias se tiñen de rojo, las capsulas de azul.

• Cubrir la laminilla con fucsina, fenicada fuerte y calentar ligeramente durante 1 min.
• Lavar rápidamente con etanol, después lavar perfectamente con agua.
• Cubrir con el mordente de Muir durante 30 segundos.
• Lavar con agua y con etanol durante 30 segundos o hasta que el frotis tome un color rojo pálido.
• Lavar perfectamente con agua.
• Contrastar con azul de metileno durante 30 segundos.
• Lavar y dejar escurrir o secar en papel secante.
• Observar al microscopio.

Tinción de esporas

Utiliza verde de malaquita para la tinción de la espora y una solución de safranina como colorante de contraste.

Las esporas se observan de la manera más simple como cuerpos refringentes intracelulares en suspensiones de bacterias sin teñir, o como zonas incoloras dentro de las células bacterianas teñidas con los métodos habituales. La pared de la espora es relativamente impermeable, no obstante, los colorantes pueden penetrarla si se calienta la preparación. La misma impermeabilidad sirve, por lo tanto, para prevenir la decoloración de la espora durante el periodo de tratamiento con alcohol, suficiente para decolorar las células vegetativas. Finalmente estas últimas pueden ser contrastadas.

Las esporas comúnmente se tiñen con verde de malaquita o carbolfucsina.

• Preparar frotis de los cultivos en proceso de identificación.
• Cubrirlos con verde de malaquita.
• Calentar hasta producir vapor durante 5 minutos (como se hizo en el método de tinción de bacilos acido – resistentes).
• Dejar que la preparación se enfrié durante otros 5 minutos.
• Enjuagar con cuidado durante una corriente suave de agua.
• Agregar safranina durante un minuto, para contrastar.
• Lavar con cuidado como se hizo en el paso 5, secar con presión leve y observar mediante el objetivo de inmersión.