MICROBIOLOGIA FRUTAS Y VERDURAS

DETERMINACIÓN DE COLIFORMES Y ESCHERICHIA COLI EN FRUTAS Y VERDURAS

UTILIDAD DE LA DETERMINACION DE COLIFORMES Y E.COLI EN ALIMENTOS

Se ha determinado que no es práctico analizar todos los alimentos que son procesados para detectar la presencia de bacterias patógenas. Desde hace mucho tiempo, la calidad sanitaria de los alimentos se ha determinado buscando la presencia de microorganismos indicadores cuya presencia en mayor número indica si el alimento es de calidad sanitaria aceptable.

La interpretación de la presencia y abundancia de coliformes en alimentos generalmente es considerada como un triple significado en microbiología sanitaria y que es un indicador de contaminación fecal o malas prácticas de trabajo en el manejo de alimentos, como causa de alteración de alimentos y como agentes etiológicos de enteritis.

En productos alimenticios que han recibido un tratamiento térmico (pasteurización, horneado, cocción, etc.), se utilizan como indicadores de malas prácticas sanitarias.

AGAR BILIS ROJO NEUTRO CRISTAL VIOLETA

Violet Red Bilis Agar (VRBA) también conocido como Agar Rojo Neutro Cristal Violeta (RNCV), este método es utilizado para realizar recuento de bacterias del grupo coliformes, como indicador sanitario.

El grupo coliformes incluye bacilos Gram negativos, aerobios y anaerobios facultativos, no esporulados, que fermentan la lactosa formando ácido y gas dentro de 48 horas a 35ºC. Este grupo incluye a los géneros: Escherichia, Citrobacter, Klebsiella y Enterobacter

Contiene peptona como fuente de carbono y nitrógeno. Extracto de levadura como fuente de complejo vitamínico B, el cual estimula el crecimiento bacteriano. Las sales biliares y el cristal violeta inhiben el desarrollo de Gram positivos. Lactosa como fuente de carbohidrato y rojo neutro como indicador de pH.

Los coliformes son bacterias que fermentan la lactosa, acidifican el medio y producen un viraje del indicador de pH al color rojo intenso. Debido a esto, se observan como colonias de color rojo púrpura, de 1 a2 mm de diámetro, rodeadas, generalmente, de una zona rojiza de bilis precipitada.

Para la confirmación de coliformes se debe traspasar colonias aisladas a Caldo Bilis Verde Brillante.

El Violet Red Bilis Agar (VRBA) también conocido como Agar Rojo Neutro Cristal Violeta (RNCV) es un medio para la investigación presuntiva y recuento de coliformes en alimentos y productos lácteos.

OTRAS PRUEBAS DE CONFIRMACIÓN PARA ESCHERICHIA COLI EN ALIMENTOS

RECUENTO DE E. COLI EN ALIMENTOS UTILIZANDO AGAR VRB-MUG

CAMPO DE APLICACIÓN Y ALCANCE

Muestras de alimentos que se requiera realizar método rápido de Recuento de E. coli

FUNDAMENTO

La incorporación de 4-methylumbelliferyl- beta- D- glucoronide (MUG) en Agar Rojo Neutro permite la detección de E. coli de entre otras colonias coliformes a través de la detección de la actividad beta- glucoronidasa. E. coli produce la enzima beta-glucoronidasa la cual hidroliza el MUG produciendo un compuesto fluorogenico detectable con luz UV a 366 nm.

Las cepas típicas de E. coli, colonias rojas con precipitación biliar, muestran fluorescencia. Los coliformes que no son E. coli pueden producir colonias rojas con zonas de precipitación biliar pero son MUG negativas.

METODO DEL NÚMERO MÁS PROBABLE

La determinación de microorganismos coliformes totales (entre ellos E.coli) por el método del Número más Probable (NMP), se fundamenta en la capacidad de este grupo microbiano de fermentar la lactosa con producción de ácido y gas al incubarlos a 35°C  1C durante 48 h., utilizando un medio de cultivo que contenga sales biliares. Esta determinación consta de dos fases, la fase presuntiva y la fase confirmativa.

En la fase presuntiva el medio de cultivo que se utiliza es el caldo lauril sulfato de sodio el cual permite la recuperación de los microorganismos dañados que se encuentren presentes en la muestra y que sean capaces de utilizar a la lactosa como fuente de carbono. Durante la fase confirmativa se emplea como medio de cultivo caldo lactosado bilis verde brillante el cual es selectivo y solo permite el desarrollo de aquellos microorganismos capaces de tolerar tanto las sales biliares como el verde brillante.

La determinación del número más probable de microorganismos coliformes fecales se realiza a partir de los tubos positivos de la prueba presuntiva y se fundamenta en la capacidad de las bacterias para fermentar la lactosa y producir gas cuando son incubados a una temperatura de 44.5  0.1C por un periodo de 24 a 48 h.

DETERMINACIÓN DE E.COLI POR MEDIO DE E.M.B. Agar.

Este medio (también denominado E.A.M.) es utilizado para el aislamiento selectivo de bacilos Gram negativos de rápido desarrollo y escasas exigencias nutricionales. Permite el desarrollo de todas las especies de la familia Enterobacteriaceae.

Fundamento

Este medio combina las fórmulas de Holt-Harris y Teague con la de Levine, para obtener un mejor rendimiento en el aislamiento selectivo de enterobacterias y otras especies de bacilos Gram negativos. La diferenciación entre organismos capaces de utilizar la lactosa y/o sacarosa, y aquellos que son incapaces de hacerlo, está dada por los indicadores eosina y azul de metileno; éstos ejercen un efecto inhibitorio sobre muchas bacterias Gram positivas. Muchas cepas de Escherichia coli y Citrobacter spp. presentan un característico brillo metálico. Las cepas que utilizan la lactosa poseen centro oscuro con periferia azulada o rosada, mientras que las que no lo hacen son incoloras. Este medio permite el crecimiento de Candida spp. como colonias rosadas y puntiformes; la siembra en profundidad permite el desarrollo de clamidosporas en C. albicans. Enterococcus spp. crece en este medio como colonias puntiformes y transparentes, mientras que Acinetobacter spp. y otras bacterias oxidativas pueden dar colonias de color azul lavanda; esto puede ocurrir aunque las cepas no sean capaces de acidificar a partir de lactosa al 0.5% y ello se debe a la incorporación de azul de metileno a sus membranas. En este medio se obtiene además, un buen desarrollo de especies de Salmonella y Shigella.

Resultados

Microorganismos Tipo de Colonia

Escherichia coli ATCC 25922 Verdosas con brillo metálico y centro negro azulado

Klebsiella pneumoniae ATCC 700603 Mucosas, rosa púrpura, confluentes

Proteus mirabilis ATCC 43071 Incoloras

Enterococcus faecalis ATCC 29212 Incoloras, pequeñas, puntiformes

Shigella flexneri ATCC 12022 Incoloras

Salmonella typhimurium ATCC 14028 Incoloras

Mac Conkey Agar.

Este medio se utiliza para el aislamiento de bacilos

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