Mapa Fisico De Plasmido
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Pontificia Universidad Católica de Chile
Facultad de Ciencias Biológicas
BIO 226E: Genética y evolución
TRABAJO PRÁCTICO N°1:
CONFECCION DE UN MAPA FISICO
Y
ANALISIS DE UNA SECUENCIA DE DNA
Alumna: Francisca Cifuentes
Profesores: María del Pilar Carvallo
Sylvain Faugeron
Instructora: Patricia Gajardo
Fecha de entrega: 12 de abril de 2011
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A. Mapa físico del plasmidio pBR322
Objetivo:
Realizar la digestión del plásmido pBR322 utilizando las enzimas de restricción EcoRI,
AvaI y PstI; separar los fragmentos obtenidos mediante electroforesis en gel de Agarosa
1% y determinar el mapa físico de dicho plásmido de acuerdo a los resultados.
Resultados:
Una vez obtenido el revelado de la electroforesis en gel, con los fragmentos obtenidos de
la digestión celular y el estándar, se procedió a calcular la recta que representa el
desplazamiento de las bandas del estándar. Para ello se midió la distancia en centímetros
desde el posillo donde se cargó la muestra y se calculó el Log del tamaño en pares de bases
correspondiente a cada banda, tal como se muestra en la Tabla I. Finalmente, se graficaron
los datos y se obtuvo la regresión lineal (Figura 1) que nos permitiría calcular el tamaño de
las bandas del plásmido en función a su desplazamiento en el gel de agarosa.
y = -0,1314x + 4,2506
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
0 5 10 15 20
distancia (cm)
log tamaño
Tamaño (pb) Log Distancia (cm)
1632 3,2127 7,4
517 2,7134 11,9
396 2,5976 12,8
344 2,5365 13,4
298 2,4742 13,8
221 2,3443 14,7
154 2,1875 15,6
75 1,875 17,4
Tabla I: Desplazamiento de las bandas estándar en gel de agarosa por electroforesis
Figura 1: Grafico del
logaritmo del tamaño
de las bandas
medidas en pares de
bases v/s su
desplazamiento. Se
obtuvo la regresión
lineal con pendiente
negativa
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Para determinar el tamaño en pares de bases de las bandas obtenidas en el gel, se reemplazó
la distancia de desplazamiento en la ecuación de la recta obtenida y mostrada en la Figura
1y luego se calculó el antilogaritmo. Estos cálculos nos dan una aproximación del lugar en
que cortan las enzimas una respecto a la otra y los tamaños de los fragmentos obtenidos se
observan en la Figura 2.
Mapa físico del plásmido:
Una vez que se tienen los tamaños de las bandas, se puede estimar la posición relativa en
que cortó cada enzima, sin embargo, en este paso nos encontramos con un inconveniente
proveniente de los resultados obtenidos. Si se observa la Figura 2 con detención, se observa
que el total de bases cuantificadas en cada carril no coincide con el resto. Estos resultados
inconsistentes impiden la cuantificación exacta de los pares de bases existentes en cada
fragmento y la determinación de un mapa físico con fragmentos coherentes con la cantidad
total de pares de bases.
Para solucionar el problema del tamaño inconsistente de las bandas, se puede trabajar con
proporciones en lugar de números definitivos. Así, en los carriles en que se obtuvo mas de
una banda, se cuenta el numero de bases totales que se desplazaron, sumando el tamaño de
Figura 2: Electroforesis en gel
de agarosa.
Se observan las bandas
obtenidas mediante
electroforesis y el tamaño
correspondiente a cada una
de ellas. La banda 1
corresponde al plasmidio sin
digerir. De 2 a 5 las enzimas
usadas fueron: 2. EcoRI; 3.
AvaI y EcoI; 4. PstI y EcoRI; 5.
AvaI y PstI. La banda de la
derecha corresponde al
est´´andar a partir del cual se
calcularon los tamaños en
pares de bases debajo de cada
banda.
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ambas bandas y luego se determina a que fracción del total corresponde cada una por
separado. Por ejemplo, para el juego enzimático del carril numero 3 se obtuvieron 2
bandas, una de 3.587 pb y otra de 1.786 pb. Esto da un total de 5.373 pb, de las que la
primera banda representa 2/3 y la segunda 1/3. Con estos coeficientes, es posible realizar un
esquema que representa los fragmentos obtenidos y las fracciones que ellos representan en
relación al total del nucleótidos del plásmido. En la Figura 3 se observan las
representaciones de cada uno de los cortes, que son la primera aproximación para llegar al
mapa físico.
Figura 3: Mapas de los fragmentos producidos en las digestiones correspondientes a las
bandas obtenidas en cada carril.
Se representan los cortes presumibles de cada enzima de restricción a partir de las bandas
observadas en la Figura 2. Los números en el centro de los plásmidos se corresponden con el
número del carril de donde provienen. Los tamaños de cada fragmento se indican como la
fracción del total a la que corresponden. En el juego 4 se muestran las 2 posiciones relativas
posibles considerando sólo la información entregada en los carriles anteriores, esta disyuntiva
se resuelve en el juego 5, dando un solo resultado posible.
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Se destaca de la Figura 3 que existen 2 opciones para el juego enzimático numero 4, aun
cuando a simple vista se podría decir que no son diferentes dado que los fragmentos
obtenidos son los mismos tanto en a como en b. Sin embargo, esta consideración es
importante pues a la hora de juntar la información de este carril con la del carril 3, no sería
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