Muestreo consecutivo. ubicación temporal y espacial

Tesis

7. Material y métodos 7.1.

Tipo de estudio Estudio de prueba diagnóstica.

 Muestreo consecutivo.

ubicación temporal y espacial

De marzo de 2016 a febrero de 2017, de 369 mujeres de 22 a 85 años de edad, se estudiaron 162 (52.95%) pacientes atendidas en la Clínica de Colposcopia del Hospital de Gineco Pediatría 3A IMSS, del Hospital General de Tlaxcala y del Servicio de Radioterapia de la UMAE H. de Oncología del CMN SXXI IMSS. La inmunotinción dual p16INK4A/p14ARF, la genotipificación de VPH en las muestras cervicales y el análisis estadístico de los resultados, se realizaron en el laboratorio de Patología Celular y Molecular del Cáncer, ubicado en la Unidad de Investigación Médica en Enfermedades Oncológicas de la UMAE de Oncología, en colaboración con la Unidad de Investigación Epidemiológica y Servicios de Salud del Centro Médico Nacional Siglo XXI, IMSS.

Definición de las variables de estudio

Las variables independientes, consideradas en las características basales de la población se describen en la Tabla 4. En la Tabla 5 se describen los grupos de Casos (NIC2+) y No casos (£ NIC1) en función del diagnóstico histopatológico. Se definieron los Casos (NIC2+) como aquellos que correspondieron a las lesiones intraepiteliales escamosa de alto grado: NIC2, NIC3 e in situ y Cáncer invasor. Los No casos (£ NIC1) fueron aquellas biopsias con diagnóstico histopatológico de lesión intraepitelial de bajo grado (NIC1), infección por VPH y cervicitis (proceso inflamatorio que incluye reparación, regeneración y negativo a lesión). La variable dependiente, fue el resultado de la inmunotinción dual p16INK4A/p14ARF. Para los propósitos de este trabajo, se consideró como inmuntinción dual positiva, cuando al menos en una misma célula epitelial se observó la presencia de ambas proteínas (p16INK4A, en color café-marrón localizado en el citoplasma y/o núcleo y p14ARF en color 34 rojo, localizado en el núcleo y/o nucleolo. Como control negativo de la inmunotinción dual, cuando se apreciaron individualmente las proteínas p16INK4A y p14ARF en las células cervicales (Tabla 5). Tabla 4. Variables Sociodemográficas: Edad (años),Inicio de vida sexual (años), Número de parejas sexuales, Número de partos, Escolaridad, Tabaquismo, Uso de condón y Estado civil de las pacientes. 35 Tabla 5. Variables Clínicas: Detección dual p16INK4A/p14ARF en citología cervical (variable dependiente). No casos (£NIC1) incluyó los resultados histoppatológicos de cervicitis y lesión escamosa intraepitelial de bajo grado. Casos (NIC2+) incluyó los resultados histopatológicos de lesión escamosa intraepitelial de alto grado y cáncer. 36 7.4. Criterios de inclusión, de no inclusión y de eliminación Se incluyeron participantes sin tratamiento previo, con prueba de detección de VPHar positiva, evaluación histopatológica, colposcopica y citológica. No se incluyeron: mujeres embarazadas, mujeres positivas a VIH o con histerectomía. Se eliminaron muestras mal etiquetadas, muestras con material cervical insuficiente y/o material mal conservado

Los resultados de 37 los estudios solo fueron revelados a las pacientes en forma confidencial. En relación a la reputación y posibles represalias sociales derivados de la revelación de los datos recopilados a personas ajenas a la investigación, éstos fueron minimizados con el manejo confidencial por parte del investigador con uso de código de identificación alfanumérico para cada paciente. Del mismo modo el conocimiento de los datos totales fue resguardado por el investigador. De los beneficios directos derivados de la presente investigación, fue el recibir el tratamiento específico para la infección, así como el seguimiento a largo plazo. 7.6. Tamaño de la muestra Con el software WinEpi:Working IN EPIdemiology se calculó que 136 participantes como mínimo, fue un tamaño de muestra adecuado para realizar el estudio, considerando un nivel de confianza del 95%, potencia del 80% y error estandar del 4%, para una proporción esperada de 94% de células positivas a la tinción dual p16INK4A/p14ARF 67 en lesiones cervicales NIC2+. 7.7. Obtención de la muestra cervical Durante la exploración ginecológica a todas las participantes se les tomaron 2 cepillados cervicales con cytobrush, estudio colposcópico y toma de biopsia dirigida por colposcopía. Los datos con los que se etiquetaron las muestras fueron: folio consecutivo, nombre de la participante (codificado para mantener su confidencialidad), número de afiliación al IMSS, tipo de lesión y tipo de muestra. Las muestras cervicales se colocaron dentro de un tubo de polipropileno de 15 ml de capacidad que contenía 2 ml de Preservcyt Solution (Cytyc Corp., Marlborough, MA, USA) Ò. Uno de los cepillados se utilizó para la extracción de ADN genómico y deteccióntipificación de VPH por LINEAR ARRAY HPV Genotiping Test (Roche) que permite reconocer 37 tipos virales, incluidos los VPH16 y VPH18. Con el otro cepillado se hicieron citologías de base líquida en laminillas electrocargadas para la inmunotinción dual p16INK4A/p14ARF. La biopsia, guiada por colposcopia (Colposcopio Labomed con 38 iluminación LED de 50W, Labomedmeditech.com) 68 se introdujo en un vial con formol amortiguado al 4%, rotulada y entregada, para su procesamiento e interpretación al departamento de patología del mismo hospital. El resultado de colposcopía fue emitido por dos ginecólogas colposcopistas. Mientras que el resultado citológico e histopatológico por dos citotecnólogos y un patólogo (en caso de existir discordancia entre los resultados de las pruebas mencionadas, se realizaron tres observaciones). La prueba de referencia fue el reporte histopatológico. 7.8. Detección y tipificación de VPH en muestras cervicales Para la detección de VPH, se realizó la extracción de ADN genómico de las muestras cervicales con el Kit Genomic DNA Purification (Promega Corporation, USA) 69. Con el sistema LINEAR ARRAY HPV Genotiping Test (Roche) se efectuó la detección y tipificación de VPH, siguiendo las recomendaciones del fabricante. Esta prueba se basa en la amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de las secuencias blanco (L1) del ADN de VPH, seguida por la hibridación de los ácidos nucleicos con sondas específicas, de tal forma que es posible detectar 37 tipos específicos de VPH: 18 tipos de bajo riesgo oncogénico (VPHbr); 6, 11, 40, 42, 54, 55, 61, 62, 64, 67, 69, 71, 72, 81, 83 (MM7), 84 (MM8), IS39, 89 (CP6108). Trece tipos de alto riesgo (VPHar); 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68, y 6 tipos de probable alto riesgo (VPHpar); 26, 53, 66, 70, 73 (MM9), 82 (MM4). Para los propósitos de este estudio las muestras positivas a infección por VPHar fueron todas aquellas que hibridaron para cualquiera de los 13 tipos clasificados como VPHar 70. 7.9. Inmunicitoquímica 7.9.1. Cultivo de HeLa y SiHa como control positivo de la inmunotinción dual p16INK4A/p14ARF Se realizaron cultivos de líneas celulares (en medio D-MEMF12 con glutamato y 10% de Suero Fetal Bovino a temperatura de 37ºC y CO2 atmosférico al 5%) derivadas de cáncer como controles positivo y negativo para la inmunotinción dual de p16INK4A y p14ARF. 39 Control positivo: HeLa (VPH18) y SiHa (VPH16). Control negativo: MCF-7 y MDA-BA 231 (VPH negativo, gen CDKN2A deletado). Se consideró positivo, cuando en al menos una misma célula, se observó la proteína p16INK4A en el citoplasma y/o núcleo (color cafémarrón, resultánte del rebelado con Diamino bencidina “DAB”, Abcam) 71 y p14ARF en núcleo-nucleólo (color rojo, que resulta de rebelado con “PermaRed/AP”, DB) 72. 7.9.2. Protocolo de inmunotinción dual p16INK4A/p14ARF en muestras cervicales Las células epiteliales cervicales, inmersas en Preservcyt SolutionÒ, fueron recuperadas mediante centrifugación. Después se separaron del detritus celular y moco cervical por gradiente de densidad según el protocolo CytoLayer Density Gradient de BioSB 73, y finalmente fueron colocadas en laminillas electrocargadas. La inmunocitoquímica se realizó conforme al protocolo del sistema Match 2 Double Stain 2 (mouse-HRP + RabbitAP) Biocare Medical 74. Los anticuerpos primarios fueron anti-p16INK4A monoclonal antiratón Ab-16123 75 y anti-p14ARF policlonal anti-conejo Ab-129755 76 (ABCAM Inc. USA). El sistema de rebelado en las muestras cervicales fue semejante al utilizado en líneas celulares. La contratinción se hizo con Hematoxilina de Harris. 7.9.3. Evaluación de la inmunotinción dual p16INK4A/p14ARF en citología cervical. La evaluación de la inmunotinción dual p16INK4A/p14ARF, cegada al resultado histopatológico, citológico y detección de VPHar, la hicieron 2 citotecnólogos. Posteriormente un patólogo revisó los casos positivos y los de discordancia. Para los propósitos de este trabajo, se elaboró una hoja para reportar los resultados de lectura de la tinción dual p16INK4/p14ARF. 1) En este reporte se anotó el número de la caja, el número de la laminilla y el número de muestra. 2) En la columna de Control p16INK4A, se anotó 1 en caso de observar control positivo para dicho marcador, 0 en caso de no observar dicho control positivo. Se consideró control positivo cuando al menos una célula en la laminilla fue teñida de color café-marrón en el citoplasma. 3) En la columna Control p14ARF, se anotó 1 en caso de observar control positivo para dicho marcador, 0 en caso 40 de no observar dicho control positivo. Se consideró control positivo cuando al menos una célula en la laminilla, fue teñida de color rojo en el núcleo-nucleólo celular. 4) En la columna Diagnóstico se registró con 1 para una lectura positiva, 0 para una lectura negativa y N/A cuando se considere no apta para lectura de p16INK4A/p14ARF. Se consideró una prueba de inmunocitoquímica positiva cuando se identificó al menos una célula cervical en la que se presentaron simultáneamente lo dos marcadores; p16INK4A (citoplasma teñido de color café-marrón) y p14ARF (núcleo-nucleólo de color rojo). Una prueba negativa fue aquella en la que no se observan los marcadores en una misma célula, pero que la laminilla cuenta con controles positivos para cada marcador en forma independiente. 5) Se registró en la columna Observaciones cualquier comentario adicional que se consideró oportuno para el diagnóstico inmunocitoquímico. 7.10. Análisis estadístico Se realizó un análisis estadístico descriptivo en 162 muestras cervicales para resumir las características sociodemográficas y estilo de vida de la población. Las variables cuantitativas, con libre distribución se analizaron con la prueba de U de Mann-Whitney para dos muestras independientes (Casos y No casos) y conocer las diferencias en las medianas. Las proporciones de las variables de los Casos y No casos, fueron analizadas con una prueba de Chi2 . El desempeño de la tinción dual se obtuvo para muestras cervicales VPHar positivas, a partir de las tablas de contingencia correspondientes, se cálculo la sensibilidad, especificidad, los valores predictivos positivo y negativo y las razones de verosimilitud de la citología con inmunotinción dual p16INK4A/p14ARF, para detectar NIC2+ (NIC 2, NIC 3 y Cáncer invasor). Se estimaron los intervalos de confianza de 95%. Un valor de p < 0.05 fue considerado estadisticamente significativo. El análisis estadístico se llevó a cabo con el software SPSS versión 24.0 (IBM Corp.). 41 8

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