Método De Aislamiento Y Cultivo Puro De Bacterias.

Introducción

En los ambientes naturales los microorganismos se encuentran usualmente como poblaciones mixtas, pero si queremos estudiarlos, caracterizarlos e identificarlos, necesitamos tenerlos como cultivos puros.

Un cultivo puro es aquel en el que todos los microorganismos provienen de una sola célula.

La obtención de un cultivo puro, a partir de una población mixta, se lleva a cabo en dos etapas:

1. La muestra debe diseminarse de manera tal que los diferentes microorganismos queden lo suficientemente separados sobre la superficie de un medio de cultivo sólido, de manera que luego de la incubación ellos formen colonias visibles aisladas. Este proceso se conoce como aislamiento. En esta placa tendremos diferentes tipos de colonias correspondientes a los diferentes microorganismos presentes en la población original.

2. Luego de tener las colonias aisladas, éstas deben transferirse con el filamento a un tubo que contenga agar nutritivo estéril para cultivar esa colonia aislada; este procedimiento se conoce como transplante.

Para garantizar la pureza del cultivo obtenido, es conveniente, a partir de cada tipo de colonia aislada, repetir el proceso de aislamiento antes descrito. Se considerará que se ha obtenido un cultivo puro, cuando al realizar este proceso, todas las colonias obtenidas presenten las mismas características. El medio de cultivo utilizado en el proceso de aislamiento dependerá, entre otros factores, de los requerimientos nutricionales de los microorganismos que se espera aislar y de la presencia de microorganismos que, por sus características y/o por la cantidad en que se encuentren en la muestra, dificulten la obtención del microorganismo objeto del aislamiento. En este último caso, se deben utilizar medios de enriquecimiento y medios selectivos que inhiban el desarrollo de gérmenes contaminantes. La temperatura y otras condiciones de incubación, variarán según los microorganismos, usualmente la temperatura óptima de los microorganismos patógenos para el hombre oscila entre 30 y 40ºC. Cuando el microorganismo que se intenta aislar es anaeróbico, deben tomarse las precauciones necesarias a fin de eliminar la presencia de oxígeno en el ambiente donde se desarrollará el mismo.

Basándose en el origen y naturaleza de la muestra se pueden inferir los posibles

microorganismos que se encuentran presentes en la misma, y ese conocimiento ayudará en la selección del medio y las condiciones de cultivo adecuadas.

Métodos de aislamiento de bacterias.

Método de enriquecimiento.

No es frecuente que un ambiente natural tenga un solo tipo de microorganismo. En muchos casos existe una comunidad microbiana y el desarrollo de métodos y procedimientos que permitan el aislamiento y cultivo de microorganismos de interés, es un reto que se presenta al microbiólogo el enfoque más corriente para conseguirlo consiste en la técnica del cultivo de enriquecimiento. Este método requiere un medio de cultivo y unas condiciones de incubación selectivos para el organismo que se desea aislar y contra selectivos para organismos no deseados. La estrategia del cultivo de crecimiento consiste en conseguir en primer lugar, una réplica lo más fiel posible de las condiciones que se dan en el nicho y buscar luego los habitantes potenciales de aquel nicho.

Para que un cultivo de enriquecimiento tenga éxito es necesario contar con un inoculo apropiado. Por tanto la metodología del cultivo de enriquecimiento se inicia con la elección del hábitat adecuado donde se tomarán muestras para obtener el inóculo. El cultivo de enriquecimiento suele establecerse sembrando el inóculo directamente en un medio altamente selectivo; muchos de las procariotas más frecuentes pueden aislarse de esa manera. Por ejemplo durante la pasteurización del inóculo, que matará las células vegetativas, es posible aislar organismos formadores de esporas en varios medios de enriquecimiento. Azotobacter, una bacteria fijadora de nitrógeno, puede aislarse fácilmente en condiciones aeróbicas en un medio que contenga Manitol y Sales minerales y que carezca de nitrógeno combinado. Literalmente son centenares los métodos que se han ensayado para el cultivo de enriquecimiento.

Métodos de cultivo de enriquecimiento para procariotas

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Bacterias fototróficas (con luz): principal fuente de C y CO2

Organismo enriquecido: Cianobacterias

Incubación aeróbica: N2 como fuente de nitrógeno Organismo enriquecido: Cianobacterias

Incubación aeróbica: N2 como fuente de nitrógeno Organismo enriquecido: Cianobacterias termofílicas.

Incubación aeróbica: N3 como fuente de nitrógeno, 55°C

Inóculo: Aguas de charca o lacustres; lodos ricos en sulfuro; aguas estancadas; aguas residuales sin tratar, lecho de hojas descompuestas y húmedas; suelos húmedos expuestos a la luz.

Organismo enriquecido: Bacteria roja no del azufre, heliobacterias.

Incubación anaeróbica: H2 o ácidos orgánicos, N2 como única fuente de nitrógeno.

Organismo enriquecido: Bacterias rojas y verdes del azufre.

Incubación anaeróbica: H2S como donador de electrones.

Inóculo: Tapetes microbianos de fuentes termales.

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Bacterias quimiolitotróficas no fotosintéticas (sin luz): principal fuente de C, CO2 (el medio debe carecer de C orgánico).

Incubación aeróbica

Organismo enriquecido: Bacterias nitrosificantes (Nitrosomonas).

• Donador de electrones: NH4

Organismo enriquecido: Bacterias Nitrificantes (Nitrobacter)

• Donador de electrones: NO2¬¬-

Organismo enriquecido: Bacterias del hidrogeno (varios generos)

• Donador de electrones: H2

Organismo enriquecido: Thiobacillus spp.

• Donador de electrones: H2S, S0, S2O32-

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