ELECTROFORESIS DE ÁCIDOS NUCLEICOS EN GELES DE AGAROSA

I. OBJETIVO

Conocer y Verificar mediante la electroforesis la calidad y la cantidad relativa de DNA presente en las muestras.

II. INTRODUCCIÓN

Uno de los elementos básicos del desarrollo de la ingeniería genética ha sido la posibilidad de separar fragmentos de DNA, en este sentido las técnicas cromatografías han resultado útiles para la separación de ADN plasmídico a partir de DNA genómico, así como para aislar DNA genómico a partir de lisados celulares, sin embargo las técnicas de electroforesis ofrecen mayor resolución y es generalmente el método de fraccionamiento más utilizado; La separación por electroforesis de ácidos nucleicos (DNA/RNA) es en general tan simple como su aplicación para la resolución de proteínas, y puede considerarse tanto como una técnica analítica como preparativa debido a que proporciona resultados cualitativos (Bueno, malo, poco, mucho), y resuelve fragmentos de DNA que van desde ,0.5 a 25 Kb.

El término electroforesis se usa para describir la migración de una partícula cargada bajo la influencia de un campo eléctrico. Muchas moléculas importantes biológicamente (aminoácidos, péptidos, proteínas, nucleótidos, ácidos nucleicos…) poseen grupos ionizables y existen en solución como especies cargadas, bien como cationes, o bien como aniones. Estas especies cargadas se van a separar en función de su carga cuando se aplica un voltaje a través de los electrodos. Existen muchos tipos de electroforesis, que se engloban en dos categorías fundamentales: (Nelson DL,2001).

La electroforesis en gel es una técnica muy utilizada para separar moléculas o fragmentos de moléculas de ácidos nucleicos. Los materiales más comune para separar moléculas de ácidos nucleicos son polímeros como la poliacrilamida o la agarosa. Estos geles se colocan en la cubeta de electroforesis, sumergidos en un tampón de pH alrededor de 8. De esta forma, las moléculas de DNA o RNA sometidas a electroforesis se desplazarán al polo positivo ya que a pH superiores a 5 poseen carga negativa. Los geles se comportan como un tamiz molecular y permiten separar moléculas cargadas en función de su tamaño y forma. Así, moléculas de DNA de diferente tamaño, van a emigrar de forma distinta en un gel de electroforesis. La distancia recorrida por cada fragmento de DNA va a ser inversamente proporcional al logaritmo de su peso molecular. Es importante la utilización de marcadores de tamaño conocido porque nos permitirán calcular los pesos moleculares de las muestras de DNA problema. (Nelson DL, 2001).

En el caso de los geles de agarosa, se le añade bromuro de etidio, sustancia que se intercala entre las bases del DNA y es fluorescente cuando se ilumina con luz ultravioleta. Tras la electroforesis, se visualiza el gel con una lámpara de luz UV, y se verán las bandas correspondientes a las muestras de DNA aplicado y los marcadores de peso molecular. (Stryer L,2003):

Casi siempre los equipos de electroforesis son simples circuitos eléctricos y pueden ser entendidos usando dos simples ecuaciones. La ley de Ohm, V = IR establece que el campo eléctrico V (medido de volts); es proporcional a la corriente I (medida en miliamperes) multiplicada por la resistencia, R (medida en Omhs). La cámara de electroforesis cuenta con un polo positivo (ánodo) y un polo negativo (cátodo) que permite la generación de un campo eléctrico. Cuando una cantidad de voltaje es aplicada a un circuito, una cantidad constante de corriente fluye a través de todos los elementos y la disminución en el voltaje en cualquiera de los elementos es consecuencia directamente de su resistencia. Usualmente el gel mismo proporciona casi toda la resistencia del circuito, y el voltaje aplicado al gel será esencialmente el mismo que el voltaje total aplicado al circuito. Para una corriente dada en la que disminuye el grosor del gel o la fuerza iónica del buffer se incrementará también el voltaje a través del gel y la movilidad electroforética de la muestra. Una segunda ecuación, P = I R, establece que la potencia generada por un sistema. P (medida en Watts), es proporcional al cuadrado de la corriente multiplicado por la resistencia. La potencia producida es manifestada como calor y cualquier cámara de electroforesis puede disipar solo una cantidad de calor sin que se incremente la temperatura del gel, después de este punto pequeños cambios en el voltaje pueden provocar significantes y potencialmente desastrosos incrementos en la temperatura del gel. La azarosa es un polímero lineal que se extrae de algas marinas, y cuya estructura básica es:

Figura 1. Esquema molecular de la agarosa

Los geles de AGAROSA se realizan mediante la fundición de la agarosa en presencia del buffer de electroforesis hasta lograr una solución transparente; entonces la solución resultante es vaciada en un molde hasta que endurezca; una vez que solidifica, la agarosa forma una matriz cuya densidad es determinada por la concentración de la agarosa. Cuando un campo eléctrico es

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