APLICACIONES DE LA MICROSCOPÍA EN LA HISTOLOGÍA Y LA BIOLOGÍA MOLECULAR

CAPÍTULO 1: APLICACIONES DE LA MICROSCOPÍA EN LA HISTOLOGÍA Y LA BIOLOGÍA MOLECULAR

Microscopía fotónica

La construcción del primer microscopio se atribuye a Hans y Zacharias Jansen en 1590. Anastasius Kircher (1602-1680) realiza la primera clasificación de microscopios del siglo XVII. Anton Van Leeuwenhoek (1632-1723) fue el primero en observar el mundo microscópico por lo que fue reconocido como "Padre de la Embriología, Protozoología, Bacteriología y de la Microscopía”. Ernst Abbe (1840-1905) estableció las bases para la fabricación de lentes microscópicas.

        Sistema óptico de campo claro

La luz que llega a los oculares es totalmente neutra, por lo que el campo es blanco, permitiendo el contraste de los cortes histológicos con tinción, facilitando su observación.

Sistema óptico de luz polarizada

Existen cuatro tipos de polarización: absorción, reflexión, dispersión y birrefrigerancia (doble refracción). Este sistema utiliza como base el de campo claro, con dos polarizadores adicionales que forma un “campo de luz polarizada” o campo obscuro. Es  ideal para analizar materiales con patrón de forma y color como cristales de almidón, oxalatos, urea, etc.

        Sistema óptico de contraste de fases

Permite la observación de células y organismos vivos, revelando las diferencias entre los índices de refracción de los componentes celulares y el citoplasma, contrastándolos y evidenciándolos por su grosor y densidad. El sistema se construye a partir del sistema óptico de campo claro al que se le incorporan un par de anillos de fase.

Microscopia de fluorescencia

La fluorescencia se basa en la luminiscencia o capacidad de un cuerpo para emitir energía ultravioleta, infrarrojo o luz visible durante el paso de estado de excitación a reposo. Existen dos fenómenos, la fosforescencia en la que un cuerpo emite energía continua por un tiempo prolongado y la fluorescencia capacidad de una sustancia (fluorocromo) para absorber longitudes de onda, almacenarla y liberarla después como luz visible de mayor longitud de onda. Aprovechando este fenómeno se emplea en el microscopio una lámpara de luz UV para radiar sustancias y así poder observarlas.

Microscopio de barrido láser confocal

Sistema en el que uno o varios láser barren distintos planos focales de un mismo espécimen y forman imágenes seriadas, que son almacenadas a través de un software como archivo digital cuya nitidez y capacidad de información es 1.5 veces más que la microscopia fotónica.

Microscopia electrónica

        Microscopio electrónico de transmisión (TEM)

Conformado por una columna electrónica sometida a presión negativa, para garantizar la calidad de la imagen, la cual contiene un cilindro de Wehnelt o cañón de electrones, lentes electromagnéticas (condensadoras, objetivas y proyectoras), lentes correctoras de astigmatismo, aperturas, una platina y un sistema de enfriamiento de las lentes.

        Microscopio electrónico de barrido (SEM)

Cuenta con una columna electrónica más pequeña que el TEM, el sistema de lentes crea y modula al haz de electrones y a diferencia del TEM carece de lente proyectora, posee una cámara para espécimen. El sistema de lentes colimadoras gobiernan la rapidez del barrido del haz, así como su desplazamiento sobre la muestra, por lo que recupera información como topografía, textura, composición química y estructura cristalina ofreciendo un efecto de tercera dimensión.

        Aplicaciones especiales en la microscopia electrónica

Microanálisis

 Tanto en TEM como en SEM, cuando el haz de electrones impacta una muestra se genera la emisión de rayos x, estos son detectados por sondas especiales:

Espectroscopía por difracción de rayos x (EDS): para estudios biológicos. Capta la señal y la transmite a través de un amplificador y luego a un analizador, generando una grafica de picos de diferentes alturas relativas a la abundancia de los elementos presentes.

Espectroscopía dispersiva por longitud de onda (WDS): no se usa en estudios biológicos. Recibe las longitudes de onda y las separa por la ley de Bagg, identificando cada elemento de manera individual. Más sensible que EDS.

Espectroscopía por pérdida de energía de electrones (EELS): detecta por transmisión, diferencias de energía entre electrones que han sido transmitidos a través de un corte. Los átomos de metales pesados ligados a tejidos o células en condiciones experimentales o patológicas pueden ser revelados por esta técnica.

Criotécnicas

La criofijación aporta alta velocidad de fijación y estabilización de los componentes celulares. El nitrógeno y el etanol líquidos son exelentes criofijadores. Los métodos más communes son plunge-freezing (congelamiento por inmersión), propane jet freezing (congelamiento por propano a chorro), cold metal block freezing (congelamiento en bloque en metal frio) y high pressure freezing (congelamiento a alta presión).

Crioelectromicroscopía: Los microscopios electrónicos tienen incorporados sistemas de enfriamiento como platinas que conservan las bajas temperaturas del espécimen durante su estudio.

CrioTEM: La crioultramicrotomía es una técnica de corte a bajas temperaturas. La técnica de Tokuyasu es la más utilizada; usando una navaja de diamante y conservando los -80 a -100°C.

CrioSEM: Los especímenes son estabilizados por la criofijación y deshidratados por la criosustitución, con ayuda de platinas frías al vacío, en la platina se sombrean con carbón y se ionizan con oro. Son analizados en el microscopio electrónico de barrido.

Criofractura: Consiste en infiltrar un crioprotector (glicerina, dimetilsulfóxido), luego se congela a alta velocidad y presión, se fractura para producir un plano de fractura a través del espécimen, se coloca en un sistema de alto vacio, que se sombrea con carbón (digerir material orgánico). La réplica formada es analizada en el TEM. Por este método se han localizado proteínas asociadas a la membrana y organelos.

CAPITULO 2: TÉCNICA HISTOLÓGICA Y SUS APLICACIONES

Objetivos de la histotecnología:

• Producir cortes delgados, con preservación morfológica
• Conservar características biológicas y químicas de células y tejidos
• Estudiar la mayor parte de estructuras en un solo corte
• Correlacionar morfología y función

Pasos de la técnica histológica

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