Agrobiotecnología. Curso 2011

Agrobiotecnología. Curso 2011

Micropropagación comercial

La micropropagación masiva en la práctica comercial

Transparencias 3-22

En los últimos 20 años, el conocimiento sobre cómo propagar plantas creció en forma considerable. Sin embargo, no se han encontrado todavía métodos de producción a gran escala para la propagación masiva de plantas diferentes al método clásico de división de vástagos axilares. En la mayoría de las especies, esta técnica requiere una intensa labor de mano de obra en todos los estadios del cultivo de tejidos, especialmente en las etapas que requieren mayor manipulación: las etapas de iniciación del cultivo in vitro (Etapa I) y de la división de macollos e introducción de los plantines en recipientes con medio de cultivo semisólido (Etapa II). Estas tareas originan altos costos de mano de obra y hacen de la micropropagación masiva un proceso relativamente caro. A pesar de ello, las plantas micropropagadas siguen teniendo ventajas. Estas son: a) generación de vástagos pequeños a partir de pequeñas porciones de tejido vegetal (lo que economiza espacio físico); b) obtención de plantas libres de microorganismos contaminantes; c) clonado de especies difíciles de propagar vegetativamente; d) producción continua durante todo el año. La mayor desventaja son los altos costos implicados en establecer rutinariamente una operativa óptima de multiplicación en cada una de las especies y variedades de interés. Uno de los mayores riesgos del proceso se localiza en la etapa de aclimatación y rusticación de los plantines que provienen del cultivo in vitro.

No existen muchas empresas dedicadas a la micropropagación comercial, ya que resulta más económico reproducir plantas por semilla botánica o por propagación vegetativa (“macropropagación”). La posibilidad de utilizar micropropagación se ve muchas veces limitada por los costos asociados a esta técnica. Algunas estimaciones indican que, si se lograse un 50% de reducción en los costos, la micropropagación masiva podría expandirse 10 veces respecto del volumen actual. Si la reducción de costos alcanzara un 90%, el mercado potencial se tornaría 1.000 veces mayor respecto del actual. Actualmente, la micropropagación masiva se focaliza en las especies que presentan dificultades para su propagación por técnicas convencionales, ya sea por su velocidad de crecimiento, por ser susceptibles a contaminaciones microbianas o fúngicas, por requerir la eliminación de contaminaciones virales o por la necesidad de obtener una gran cantidad de plantas homogéneas en un corto período de tiempo.

Antes de emprender la clonación masiva, se deben considerar minuciosamente las características del material vegetal inicial (plantas madre; transparencia 6). Este debe ser óptimo, tanto desde el punto de vista fenotípico como sanitario. Un primer paso obligatorio es establecer fehacientemente la ausencia de patógenos. Si no se pudiese disponer de plantas madres sanas, existen varias estrategias efectivas para eliminar las enfermedades y lograr iniciar la micropropagación a partir de explantos sanos. Las características del explanto (meristemas, segmentos internodales, yemas, organogénesis, embriogénesis) se decidirán de acuerdo con la especie en cuestión y según los objetivos de la micropropagación. Deberá constatarse el aspecto morfológico de los vástagos regenerantes, así como ausencia de contaminantes en el medio de cultivo. Una vez establecida la estrategia de clonación, se procederá a obtener plantínes completos, implementando la etapa de enraizamiento. Esta puede efectuarse in vitro o ex vitro.

Murashige, profesor de la Universidad de California (Riverside) definió inicialmente las tres etapas principales (Etapas I a III) de la multiplicación in vitro de plantas (transparencia 7). Esta definición se ha adoptado ampliamente tanto en investigación como en los laboratorios comerciales de cultivo de tejidos, ya que no sólo describen los pasos del procedimiento sino que también definen los puntos en que debe ser modificado el medio de cultivo. Deberg y Maene propusieron que el tratamiento y preparación de las plantas madres sea considerado una etapa separada y que por lo tanto sea llamada Etapa 0. Más tarde se definió la Etapa IV, en la cual las plantas son transferidas al ambiente ex vitro. Si bien las etapas sirven como guía general, no son aplicadas de manera rígida.

Si el objetivo es reproducir plantas idénticas a las seleccionadas, lo ideal es iniciar el proceso con un tejido diferenciado como el meristema, los ápices caulinares o segmentos internodales (transparencia 8). En la medida de lo posible, se trata de no permitir la desdiferenciación de los tejidos, ya que ello aumenta la posibilidad de variantes somaclonales. Se puede partir del meristema propiamente dicho (2-3 mm) o aislar el meristema junto con los primordios foliares. Si solamente se cuenta con plantas madres infectadas, es posible sanearlas mediante exposición de los meristemas a altas temperaturas, o a sucesivos tratamientos con concentraciones crecientes de agentes desinfectantes. Estos procedimientos pueden resultar letales para porciones de tejido pequeñas, por lo que es conveniente realizarlos en paralelo con segmentos más grandes (meristema más primordios foliares). Si se parte de una planta sana factible de ser propagada por segmentos nodales, éstos se extraen y, se exponen a agentes desinfectantes. Luego se cultiva el material in vitro y se procede a su establecimiento y a su pasaje a la Etapa II.

La transparencia 9 muestra meristemas de caña de azúcar en crecimiento cultivados en frascos separados para evitar la propagación de contaminaciones. De esta manera, si algún explanto no ha sido correctamente desinfectado en la etapa inicial, se evita que la contaminación alcance a otros explantos limpios. Las características de la desinfección inicial implican una solución de compromiso entre lograr la eliminación de todos los microorganismos externos y no dañar apreciablemente el explanto con el agente desinfectante. El número ideal de explantos iniciales varía según la especie de que se trate. Se tiene en cuenta la exposición a contaminantes, la supervivencia de los tejidos a la desinfección y la tasa de multiplicación. Se parte de un número inicial basado en la cantidad de plantines viables que quieran obtenerse en las etapas posteriores. También ha de considerarse el estado fisiológico de la planta de la que se extrae el tejido inicial.

Se puede considerar que el cultivo se ha establecido in vitro si se observa crecimiento de tallos y de hojas. En este punto,

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