Análisis cualitativo y cuantitativo de proteínas

ANÁLISIS CUALITATIVO Y CUANTITATIVO DE PROTEÍNAS Y HEMOGLOINA POR ESPECTROFOTOMETRÍA 

Basthian Carvallo Córdova; Dannae Morales Gómez

basthiancar99@gmail.com

José Muñoz y Luis Álvarez

RESUMEN: 3 ptos

En el presente práctico se realizaron varias espectrofotometrías para obtener espectros de absorción y así conocer las mayores longitudes de onda que presentan cada uno de los experimentos. Tras la obtención de cada uno de estos, se realizó una curva de calibrado para cada experimento.

Palabras clave: espectrofotometría, absorbancia, espectro de absorción, curva de calibración y longitud de onda. 1 ptos

INTRODUCCION Y OBJETIVOS 5 ptos

La radiación electromagnética es una forma de energía transmitida a través del espacio, que puede describirse como una onda con características como longitud de onda, frecuencia y velocidad. El espectro electromagnético cubre un amplio rango de energía (frecuencias), por lo que, el método de utilizar o generar radiación ultravioleta, visible o infrarroja del espectro electromagnético se denomina espectrofotometría. (1)

Existen distintas técnicas analíticas de espectrofotometría que pueden proporcionar información tanto cualitativa como cuantitativa de una muestra, entre ellas está la espectrofotometría de absorción, la cual mide la energía absorbida en la región UV/visible/IR del espectro electromagnético, en una muestra en función de la longitud de onda. (1)

Un espectrofotómetro es un aparato que entrega un valor en presencia de una muestra, ese valor se conoce como absorbancia, este valor nos indica la absorción de la luz de una muestra a cierta longitud de onda. La absorbancia es directamente proporcional a la concentración de la especie química que estamos analizando, por lo que el espectrofotómetro es de gran utilidad para la identificación de especies químicas. (2)

Generalmente, la concentración del analito absorbente tiene una relación lineal con la absorbancia, y estas dos relaciones se combinan en la ley de Beer. La ley de Beer nos dice cuantitativamente cómo la atenuación depende de la concentración de moléculas absorbentes y de la longitud de la trayectoria donde ocurre la absorción (1).

Para utilizar la absorbancia con fines analíticos, se debe generar una curva de calibración en base a la medición de la absorbancia de varias soluciones que contienen concentraciones conocidas del analito en la muestra.

Los objetivos de este práctico están basados principalmente en poder determinar el espectro de absorbancia de la hemoglobina y el de los distintos tipos de hemoglobina por medio de un espectrofotómetro, la cual es una metodología muy utilizada en análisis químico, además realizar un procedimiento para determinar las distintas curvas de calibración, mediante los datos de absorbancia y por último, determinar la concentración de distintas muestras problemas.

RESULTADOS 5 ptos

Relación entre absorbancia y Concentración: 

Luego de haber preparado las 3 cubetas que contienen pNF 80 µM y agua destilada, se realizó el cálculo de la concentración de pNF en cada tubo de la siguiente forma:

1. Cubeta 1: 80 µM de p-nitrofenol x 1 ml de p-nitrofenol = concentración                  desconocida de p-nitrofenol en la cubeta x 3 ml de la mezcla 

1.              (80 µM  x 1 ml)/3 ml 
2.              Se obtuvo una concentración de p-nitrofenol igual a 26,7 µM

1. Cubeta 2: 80 µM de p-nitrofenol x 2 ml de p-nitrofenol = concentración                  desconocida de p-nitrofenol en la cubeta x 3 ml de la mezcla 

1.              (80 µM  x 2 ml)/3 ml 
2.              Se obtuvo una concentración de p-nitrofenol igual a 53,3 µM

1. Cubeta 3: 80 µM de p-nitrofenol x 3 ml de p-nitrofenol = concentración                  desconocida de p-nitrofenol en la cubeta x 3 ml de la mezcla 

1.              (80 µM x 3 ml)/3 ml 
2.              Se obtuvo una concentración de p-nitrofenol igual a 80 µM

Luego de obtener las concentraciones de p-nitrofenol en cada tubo, se midió la absorbancia de cada muestra a 405 nm (tabla 1). Luego se graficaron los datos de Absorbancia v/s concentración de p-nitrofenol (gráfico 1) y se llevó a cabo una regresión lineal, obteniendo la siguiente ecuación de la recta: Y = 0,0198 X + 0,0107 para utilizarla en la determinación de la concentración de la muestra problema de pNF.

La absorbancia de la muestra problema es igual a 0,798 y se interpolo en la ecuación de la recta. Con esto, se obtuvo la concentración de la muestra problema que es 39,76 microM.

Fundamento de un ensayo de cuantificación de proteínas 1: Luego de haber preparado las 3 cubetas que contienen el reactivo de Bradford más la solución de proteína, se realizó el cálculo de la concentración de proteína en cada cubeta de la siguiente forma:

1. Cubeta 1: 0 mg/l

1. Cubeta 2: 800 mg/l de proteína x 1 ml de proteína = concentración                  desconocida de proteína en la cubeta x 3 ml de la mezcla 

1.              (800 mg/l  x 1 ml)/3 ml 
2.              Se obtuvo una concentración de proteína igual a 266,7 mg/l

1. Cubeta 3: 800 mg/l de proteína x 2 ml de proteína = concentración                  desconocida de proteína en la cubeta x 3 ml de la mezcla 

1.              (800 mg/l  x 2 ml)/3 ml 
2.              Se obtuvo una concentración de proteína igual a 533,3 mg/l

Luego de obtener las concentraciones de proteína en cada cubeta, se midió la absorbancia de cada muestra a 595 nm (tabla 2). Luego se graficaron los datos de Absorbancia v/s concentración de proteína (gráfico 2) para utilizarla en la determinación de una muestra de concentración desconocida de proteína.

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