DETERMINACIÓN DE AMINOÁCIDOS TERMINALES CON GRUPO ALFA AMINO LIBRE. MÉTODO DE SANGER

PRÁCTICA NO. 1: DETERMINACIÓN DE AMINOÁCIDOS TERMINALES CON GRUPO ALFA AMINO LIBRE. MÉTODO DE SANGER.

BALDERAS SÁNCHEZ JOSÉ PEDRO

HERRERA JIMÉNEZ ANDREA FERNANDA

GRUPO: 4QV1

SECCIÓN 2.

M.C GARCÍA GUZMÁN RAMIRO

INTERPRETACIÓN DE LOS PASOS

1. PREPARACIÓN DEL DERIVADO DINITROFENILADO DE LA HEMOGLOBINA.

• Se colocó una pequeña cantidad de Hemoglobina, para poder disolverla con mayor facilidad utilizando el Bicarbonato de Sodio al 4.2% proporcionando un medio alcalino para evitar que el grupo amino del aminoácido N- terminal no se desprotonara y se pudiera llevar acabo la reacción de dinitrofinilación .
• El DNFB (1-fluoro-2,4-dinitrobenceno) también conocido como Reactivo de Sanger, junto con la agitación durante 1 hora aproximadamente nos ayuda a dinitrofenilar a la proteína.
• Al añadir el HCL 3N proporcionamos un medio ácido, provocando que la reacción de dinitrofenilación se detenga.
• Realizar los lavados con Éter saturado con solución acuosa de FeSO4 elimina los residuos correspondientes al DNFB que no reaccionaron, se realizaron 3 lavados mezclando por inversión y destapando el tubo entre cada lavado para liberar la presión, obteniendo así dos fases, una acuosa y otra etérea. Desechamos fase etérea.
• Al colocar el tubo a baño maría evaporamos el Éter restante de la fase acuosa, donde estará la proteína dinitrofenilada.
• Nuevamente adicionamos HCL 6N para acidificar el medio, reforzando así los enlaces de la proteína dinitrofenilada.
• Para hidrolizar y así romper los enlaces peptídicos permitiendo que se formen aminoácidos libres, requerimos condiciones específicas como son:

• 120°C
• 15 lbs/pulg2 de presión
• 3 horas
• Agua destilada

• Realizamos 3 lavados con Éter para obtener nuevamente 2 fases, en esta ocasión se desecha la fase acuosa.
• Calentamos a sequedad para eliminar residuos de Éter y enfriamos con Alcohol o Acetona.

1. CROMATOGRAFÍA EN PAPEL DE LOS AMINOÁCIDOS DINITROFENILADOS TIPO Y LA MUESTRA PROBLEMA.

• En una tira de papel Whatman del No. 1 (Retención y velocidad de filtración media) haciendo marcas de 2.5, 6.0 y 8.0 cm desde el borde. En la línea (8.0 cm) marcar 5 puntos con lápiz.
• En los primeros 3 puntos colocar DNP- Ala, DNP- Phe y DNP- Val (7 aplicaciones), en el cuatro colocar DNFB (15 aplicaciones) y en el quinto el problema (40 aplicaciones). Los primeros tres derivados se utilizaron en poca cantidad ya que son puros, el DNFB se utilizó en mayor cantidad para poder corroborar con la muestra problema si se llevó a cabo la dinitrofenilación completa o si existen residuos, la muestra problema se utilizó en mayor cantidad en caso de que hubiera algún tipo de contaminación o si hubiera muy poca cantidad de producto final.
• Colocamos la cromatografía de manera que el solvente Ácido Cítrico y Citrato de Sodio subiera de forma ascendente durante toda la noche.
• De la misma manera se realizó de forma descendente con el mismo solvente durante 6 horas.
• Finalmente se sacaron los cromatogramas de la cámara e inmediatamente se marcó con lápiz el frente del solvente y las marcas de las manchas.

RESULTADOS

(FOTO O DIBUJO A ESCALA DE LA PLACA)

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