PRÁCTICA N°1 PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO, REACTIVOS Y SOLUCIONES

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ASIGNATURA: Citogenética Humana

SECCIÓN: LC7M1      

SEMESTRE: 2019-I                                                      GRUPO: B

ALUMNO:

Gonzales Collantes, Ingrid Desyree

DOCENTE: Lic. Haydee Ana, Guadalupe Gómez

LIMA- PERÚ

2019

PRÁCTICA N°1

PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO, REACTIVOS Y SOLUCIONES

MARCO TEORICO

La calidad de los cromosomas para su correspondiente análisis va a  depender de muchos factores, entre ellos se encuentran la buena preparación de los reactivos, soluciones y medios de cultivo con sus respectivos volúmenes, tiempos y concentraciones que a continuación se detallan:

MEDIOS DE CULTIVO

Comercialmente los medios de cultivo se consiguen en polvo e hidratados, la presentación en polvo viene en frascos o sobres para la preparación de un litro. Se recomienda el empleo de medios en polvo ya que son más estables y de fácil almacenamiento.

Las especificaciones para la rehidratación de los diferentes medios (MEM, RPMI, TC 199) vienen claramente definidos en las instrucciones proporcionadas por las casa productoras.

Una vez rehidratado el medio, debe ser esterilizado por  filtración a través de una membrana de celulosa de 0.22 micras y empacado en frascos de 100 o 200 ml previamente numerados para realizar el control de esterilidad, posteriormente se procede a su almacenamiento en nevera.

FITOHEMAGLUTININA

La fitohemaglutinina M se consigue comercialmente liofilizada para rehidratar en 5 ml de agua destilada estéril y usar directamente a partir de esta preparación.

La fitohemaglutinina P es mucho mas pura y concentrada, que la fitohemaglutinina M, por lo cual se debe calcular la solución apropiada para que su concentración final en el cultivo no sea mayor de 10 mg/ml , concentración que corresponde al tope de su actividad mitogénica sin llegar a ser aglutinante.

COLCHICINA

Se prepara una Solución Madre al 0.16 % en agua destilada estéril. Congelada y protegida de la luz es estable por más de un año.

La Solución se prepara a partir de la Solución Madre diluyendo 1/10 y se aplica 0.1 ml por cada 5ml de cultivo.

CÁLCULOS

SOLUCIÓN MADRE

0.16 grs.                      100 ml                       [pic 6]

    X                               50 ml                X = 0.08 grs[pic 7]

SOLUCIÓN DE USO DIARIO

1 ml de Solución Madre + 9 ml de agua destilada                  0.16 mg/ml[pic 8]

SOLUCIÓN HIPOTÓNICA

La precisión en la preparación y el tiempo de tratamiento hipotónico son fundamentales para la obtención de metafases óptimas para su estudio: abiertas, fáciles de contar y con bajo número de cromosomas sobrepuestos.  

Existen varios tipos de soluciones hipotónicas que incluyen: suero diluido al 20 %, citrato de sodio al 1% o cloruro de potasio 0.075 M; el KCL es el más recomendado.

CÁLCULOS

KCL 0.075 M

74.56 grs.                1 M[pic 9]

    X                         0.075 M           X = 5.592 grs.                  1000 ML   [pic 10][pic 11]

COLORANTE GIEMSA

Muchos laboratorios producen el colorante Giemsa en solución lista para su uso, sin embargo también es frecuente disponer del reactivo en polvo. Para la preparación de un litro  de Giemsa se requiere:

• Colorante de Giemsa certificado en polvo       7.5 grs.
• Metanol                                                            650 ml
• Glicerina                                                          350 ml

Mezclar el metanol y la glicerina hasta obtener una solución homogénea, agitar constantemente y adicionar el colorante. Para homogenizar la solución se recomienda el empleo de perlas de vidrio. Se puede agilizar la disolución mediante un calentamiento aproximadamente a 55-60 ºC con agitación constante.

Una vez solubilizado el colorante se filtra en papel Whatman y se conserva en frasco oscuro cerrado herméticamente para evitar su deterioro.

TAMPÓN GIEMSA PH 6.8

Consiste en una mezcla de Na2HPO4  0.06 M y KH2PO4  0.06M.

CÁLCULOS

SOLUCION A:    KH2PO4 0.068M   (Potasio Fosfato monobásico) 

        P.M.  136.09 grs.                 1 M[pic 12]

                X                        0.068M        X= 8.165 grs.                1000 ML[pic 13][pic 14]

SOLUCIÓN    B:  Na2HPO4  

        P.M. 142.O2 GR                1M[pic 15]

                        X                        0.068M        X= 8.52 grs.                1000Ml   [pic 16][pic 17]

TRIPSINA 1/250

Se prepara una solución al 1 % en agua destilada 100ml.Se agita manualmente o en agitador magnético durante 10 minutos.  Se filtra con papel Whatman No 1 y se separa en alícuotas de 5 ml para almacenar congelada.

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