MANUAL PROCEDIMIENTOS CEPAIO FCQ 2010

MANUAL DE PROCEDIMIENTOS PARA LA CONSERVACIÓN Y MANEJO DEL CEPARIO DE LA FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS, UACH

M.C. Martha Cristina Portillo Ruiz

M.A. Ma. Olga González Rangel

Febrero de 2010

Revisores:

Dra. Laila N. Muñoz Castellanos

M.C. Ana Bertha Torres Reyes

M.V.Z. Martín R. Hernández Castaños

M.C. Sabina Viramontes Ramos

Dra. Gpe. Virginia Nevárez Moorillón

M.S.T. Rosalba Villalba Luna

M.C. Blanca Rosa Aguilar Guerra

Dra. Blanca Estela Rivera Chavira

M.C. Norma Herrera Díaz

Dr. Rubén Márquez Meléndez

M.C. Juan Guillermo Ayala Soto

Q.B.P. Iskra Reyes Hernández

Q.B.P. J. Jesús Jiménez Nava

ÍNDICE

I. Objetivo        6

II. Procedimientos        7

1. Solicitud de cepas        8

2. Preparación de las cepas solicitadas        9

3. Revisión de las cepas de reserva        10

III. Instrucciones        11

1. Método de siembra para obtener colonias aisladas en caja Petri        12

2. Lectura de morfología macroscópica        13

3. Técnicas utilizadas para la revisión microscópica de cepas        14

3.1. Elaboración de un frotis bacteriano        14

3.2. Lectura de morfología microscópica        15

3.3 Tinción de Gram        16

3.4 Tinción de cápsulas (Maneval)        17

3.5 Tinción de endosporas (Shaeffer y Fulton)        18

3.6 Tinción de gránulos metacromáticos (Loeffler)        19

3.7 Prueba de hidróxido de potasio al 3%        19

4. Pruebas metabólicas para la revisión de cepas        20

4.1 Catalasa        20

4.2 Amilasa        20

4.3 Ureasa        20

4.4 Coagulasa        20

4.5 Oxidasa        21

4.6 Hemolisinas        21

4.7 Medio de OF (oxidación – fermentación)        21

4.8 Caldo rojo de fenol        22

4.9 Medios de Kligler y TSI        22

4.10 Reducción de nitratos        22

4.11 Medio rojo de metilo        23

4.12 Medio Vogues Proskauer        23

4.13 Medio citrato de Simmons        24

4.14 Caldo de malonato        24

4.15 Medio LIA        24

4.16 Medio FEA        24

4.17 Medio SIM        25

4.18 Agar MacConkey        25

4.19 Agar Sal y Manitol        25

4.20 Agar TCBS        26

4.21 Prueba de sensibilidad a la bacitracina        26

4.22 Prueba de sensibilidad a la optoquina        26

4.23 Prueba de CAMP        26

5. Método de conservación de cepas        28

5.1 Conservación de cepas a -20°C        28

5.2 Reconstitución de cepas a partir de un crio-vial        29

6. Preparación de reactivos utilizados para la revisión de cepas        30

6.1 Tinciones        30

6.1.1 Tinción de cápsula        30

6.1.3 Tinción de Gram        30

6.1.4 Tinción de esporas        31

6.2 Preparación de pruebas bioquímicas        32

6.2.1 Rojo de metilo        32

6.2.2 Vogues Proskauer        32

6.2.3 Tubo estándar de McFarland (0.5)        32

6.2.4 Prueba de nitratos        33

6.2.5 Prueba de oxidasa        33

6.2.6 Prueba de desaminación de la fenilalanina        33

6.2.7 Reactivo de Kovac        33

IV. Anexos        34

1. Cepas existentes en el laboratorio de Microbiología        35

2. Formato de solicitud y entrega de cepas        38

3a. Ficha de control para bacterias Gram negativas        39

3b. Ficha de control para bacterias Gram positivas, género Bacillus        40

3c. Ficha de control para bacterias Gram positivas, género Clostridium        41

3d. Ficha de control para bacterias Gram positivas, género Corynebacterium        42

3e. Ficha de control para bacterias Gram positivas, género Enterococcus        43

3f. Ficha de control para bacterias Gram positivas, género Lactobacillus        44

3g. Ficha de control para bacterias Gram positivas, género Listeria        45

3h. Ficha de control para bacterias Gram positivas, género Micrococcus        46

3i. Ficha de control para bacterias Gram positivas, género Staphylococcus        47

3j. Ficha de control para bacterias Gram positivas, género Streptococcus        48

V. Bibliografía        49

I. OBJETIVO

Conservar y mantener el cepario existente en el laboratorio de Microbiología de la Facultad de Ciencias Químicas, para permitir el desarrollo de actividades académicas y de investigación.

II. PROCEDIMIENTOS

1: SOLICITUD DE CEPAS

Usuarios:

1. Profesores (as) de las diversas materias del Laboratorio de Microbiología I y II.
2. Investigadores, profesores (as), alumnos (as) tesistas de cualquier otro laboratorio de la Facultad de Ciencias Químicas.
3. Personal universitario acreditado o responsable en áreas afines.

Procedimiento:

1. El solicitante debe revisar la lista de cepas que se tienen registradas en el laboratorio (anexo 1), así como la ficha de control de los microorganismos, que se encuentra descrita en el documento electrónico e impreso en el cubículo de maestros del laboratorio de Microbiología I y II.
2. Para solicitar una cepa, se deberá entregar, el formato interno de solicitud y entrega de cepas (anexo 2) o una carta enviada por el solicitante. Se describirá el nombre de la (s) cepa (s), mencionando el género y  el número de identificación correspondiente. En el caso de no importar al solicitante la especie, deberá marcar enseguida del género “sp”.
3. La persona encargada del cepario recibe la solicitud y comunica por escrito, la fecha de entrega de la (s) cepa (s), la cual no excederá de 6 días hábiles.
4. En la fecha acordada, se hará entrega de la (s) cepa (s) correspondiente (s) en el medio de cultivo que el solicitante indique, siempre y cuando éste se tenga en existencia en el laboratorio.
5. La persona encargada del cepario entrega por escrito al solicitante una copia de la ficha de control actualizada (formato descrito en los anexos 3a – 3j) con las características de la cepa proporcionada.
6. La persona que recibe firma el formato de entrega (anexo 2), en donde se establece la fecha y hora. A partir de ese momento, el receptor asume la responsabilidad y resguardo de la cepa recibida.
7. Los formatos de solicitud y entrega se archivan en el expediente correspondiente.

2: Preparación de las cepas solicitadas

1. Al recibir la solicitud de cepa (s) se procede a preparar los materiales necesarios para revisar las cepa (s), considerando el control de viabilidad, la pureza, las características de cultivo (características macroscópicas), tinciones de Gram, cápsula, endosporas e inclusiones granulares (características microscópicas), y las pruebas bioquímicas correspondientes (características metábolicas). Cada una de las técnicas se encuentran descritas en el apartado de instrucciones de este manual (páginas 12 – 34).
2. Se procede a sembrar los microorganismos de reserva, sean en tubo o crio-viales (apartado 5.2 de instrucciones) en el medio de cultivo adecuado (líquido y/o sólido), se incuban 18-24 horas y se observa si se presentó un buen crecimiento.
3. De aquellos medios de cultivo con crecimiento adecuado se procede a realizar las tinciones y las pruebas metabólicas correspondientes.
4. En el caso de no obtener crecimiento, se repite el paso 2.
5. Se capturan los datos de resultados obtenidos en la ficha de control de cada cepa. Se mantiene un formato electrónico e impreso que contiene el historial de cada microorganismo, y se actualiza en cada revisión de los mismos.
6. La cepa confirmada en todas sus características se inocula en el medio de cultivo indicado por el solicitante, se incuba por 24 horas y se sella con Parafilm para su entrega.
7. Las cepas revisadas se resguardan para su posterior utilización.

3: Revisión de las cepas de reserva

1. Las cepas existentes en el cepario del Laboratorio de Microbiología I y II de la Facultad de Ciencias Químicas de la Universidad Autónoma de Chihuahua, se encuentran descritas en el listado general, en el cual se documenta el número de identificación, así como el nombre (género y especie) (anexo 1)
2. Cada cepa tiene una hoja de registro de control de la calidad de pureza y viabilidad de las mismas (anexos 3a – 3j), en donde se describe:

• Identificación de la cepa: número de identificación y nombre del microorganismo.
• Procedencia: indica si el microorganismo es de referencia, del resultado del trabajo académico o de una investigación (tesis), o si procede de algún laboratorio externo.
• Características de identificación: morfología macroscópica, morfología microscópica y características metabólicas. Las pruebas a realizar se describen en las fichas de control de acuerdo al grupo de microorganismo a tratar, y las técnicas para dichas pruebas se describen en el apartado de instrucciones de este manual.
• Fecha de revisión.
• Observaciones.

1. Las cepas revisadas se resguardan en tubo en inclinado (por duplicado) con el medio de cultivo Agar Tripticasa Soya, conservándolas a temperatura ambiente. Además, se congelan en crio-viales a una temperatura de -20°C, manteniendo siempre un stock mínimo de 5 crio-viales por cepa (apartado 5.1 de instrucciones).
2. La revisión de las cepas en tubo se hace cada tres meses.
3. En caso de tener pérdida de viabilidad y pureza o cambio de características metabólicas, la cepa se descarta, señalando en su ficha de control la fecha correspondiente. Habiendo revisado la cepa almacenada tanto en tubo como en crio-viales.
4. Cuando se tienen almacenados sólo 2 crio-viales de alguna de las cepas, se procede, de inmediato, a preparar nuevos para mantener el inventario en los números establecidos.

III. INSTRUCCIONES

1. Método de siembra para obtener colonias aisladas en caja Petri

[pic 1]

(Viramontes y Portillo, 2010)

2. Lectura de morfología macroscópica

...