Propagación de Orquidea Cattleya InVitro

Pontificia Universidad Católica de Puerto Rico[pic 1][pic 2]

Colegio de Ciencias

Recinto de Ponce

Protocolo de Orquidea (Cattleya) desde inicio, transferencia hasta Multiplicación:

Por: Elmer Fuentes González

Angélica Dávila Santiago

29 de marzo de 2016

BTEC 420

• Descripción de la planta en vivo

• Antes de la polinización en vivo:

• Inspeccione sus plantas con frecuencia. Busque síntomas de enfermedades, plagas o insectos. Detecte a tiempo si sus plantas sufren por no tener condiciones adecuadas de cultivo: pérdida o amarillamiento de hojas, falta de floración o renuevos, deterioro general.
• Las orquídeas, como cualquier planta, necesitan luz para poder realizar la fotosíntesis que convierte los minerales presentes en el ambiente en savia y nutrientes. Hojas oscuras y falta de floración indican falta de luz; hojas amarillas e incluso quemadas apuntan hacia un exceso de sol.  Diferentes especies requieren de diferentes condiciones; investigue qué es lo que su nueva planta necesita antes de condenarla a un ambiente inadecuado.
• Las orquídeas crecen en muy diferentes medios: desde el nivel del mar hasta la alta montaña, y desde el trópico hasta las zonas polares. Es obvio que cada especie necesitará de distintas condiciones de temperatura.
• Podemos clasificar a las orquídeas como de clima cálido (temperatura nocturna mínima de 20ºC); templado (mínimo de 13 a 18ºC), y de ambiente frío (de 10 a 13ºC).

• Polinización en vivo:

• Utilizar suficiente polen que se encuentra en los polinios de las antenas, son fáciles de reconocer por el color amarrillo.
• El polen debe ser transferido con la ayuda de pinzas estériles al ovario que se encuentra en el estigma de la flor.
• Asegurarse que el polen que se ha transferido y haya quedado en el estigma de la flor.
• 4 Etiquetar la flor polinizada con la fecha de polinización e identificar la planta madre donadora del polen.

• Descripción de la planta en vitro

• Introducción

• En el mundo actualmente existen alrededor de 800 géneros y más de 24,000 especies de orquídeas. Estas plantas se distribuyen en regiones y tropicales y subtropicales. La forma y los colores exóticos se debe orquídeas hibridadas aquella que se generan del cruzamiento, por estas características peculiares hoy en día el cultivo de orquídeas es algo más que una industria; es un negocio internacional (Griesbach, 2002), ya sea de manera natural (polinización) o por la ayuda del hombre. Es por eso que la propagación in vitro es una alternativa para la conservación de estas especies y su propagación en grandes cantidades. 

• Sistemas utilizados y metodología

• En este experimento se utilizarán semillas de orquídea (Cattleya), que se encuentran en una capsula.
• Seleccionar una capsula de la planta preferiblemente verde y no muy madura.
• En caso de que la capsula este muy madura y haya empezado a abrirse es mejor terminar de abrir la capsula y retirar las semillas en un papel. Se debe escoger una planta en buenas condiciones, preferiblemente que haya sido regada con agua embotellada durante su crecimiento. Tener cuidado con las semillas ya que son muy pequeñas y se pueden dispersar fácilmente Colocar las semillas en una bolsa de papel y nunca en una bolsa plástica

• Presentación del resumen de los artículos:

• Cattleya walkeriana growth in different micropropagation systems 
• (Autores: André Luís Moreira, Adriano Bortolotti da Silva, Aline Santos, Caroline Oliveira dos Reis, Paulo Roberto Correa Landgraf)

• En este artículo científico se investigaba cual de los diferentes medios de Micro propagación era más efectivo. Se utilizaron 5 métodos de micropropagación Inmersión Continua (CI), Inmersión Temporal (TI), Micropropagación Convencional (CM), Micropropagación de Ventilación Natural,(NVM) Medio Liquido.
• Los parámetros utilizados en el experimento fueron: Temperatura: 24 o, Lux 36µmol , PH 5.8, Tiempo de incubación 8 meses.
• Los resultados de esta investigación  fueron que  entre todos los medios de Micropropagación que se compararon los que tuvieron más número de  brotes, raíces, crecimiento, áreas de tejido vivo fueron el Birreactor de inmersión temporal. Y en segundo lugar, el Medio de Cultivo de Micropropagación Convencional.

• FOLIAR ANATOMY AND IN VITRO GROWTH OF Cattleya AT DIFFERENT CONCENTRATIONS OF    KEFIR, KNUDSON MEDIUM, AND SUCROSE
• (Autores: Adriano Bortolotti da SILVA ; José Maurício Schneedorf Ferreira da SILVA ; Juliana Aparecida dos Santos da SILVA ; Aluísio Hideki TOGORO)

• En este artículo científico se pretende investigar la anatomía foliar y el crecimiento in vitro de orquídeas cultivadas entre diferentes  concentraciones  del medio de Cultivo Knudson (KD), Kéfir (KF) y sacarosa.
• El kéfir es un probiótico utilizado para la nutrición humana debido a sus propiedades medicinales y nutritivas: Entre los diferentes tipos de medio de Cultivo que se prepararon están:

25% KD+ 75% KF

50% KD+ 50% KF

75% KD+ 25% KF

• Resultados: Dentro de los resultados de la investigación el medio que presento efecto significativo en el crecimiento de las hojas de las orquídeas fue el 50% KD+ 50%KF. El crecimiento de raíz lo tuvo el medio de 75%KD + 25% KF
• En conclusión, se puede decir que el uso de kéfir en orquídeas in vitro promueve un mayor crecimiento, organización y el grosor de los tejidos foliares

• Micropropagation of orchids: A review on the potential of different explants
• (Autores: Samira Chugh, Satyakam Guha, I. Usha Rao)

• Este artículo científico señala la micropropagación de la orquídea ha mostrado un desarrollo creciente en los últimos años, ayudando a promover el comercio y la exportación de esta planta a nivel mundial. Pero algunos procesos de esta micropropagación se ven limitada como la explanación y el trasplante al campo por la aparición de compuestos fenólicos.
• Este trabajo incluye investigaciones previas sobre la micropropagación de orquídeas a nivel industrial, la popularidad de la flor, fechas de demanda al año, su exportación y problemas que se podrían encontrar durante cualquier etapa de la micropropagación.

• Propósito

• El propósito de este trabajo es evaluar la micropropagación de la orquídea (Cattleya) desde su inicio, multiplicación, enraizamiento, hasta el endurecimiento a escala industrial evitando la contaminación del tejido.

• Objetivos

• Identificar las partas de la orquídea (cattleya) y el cuidado antes, durante y después del proceso de micropropagación.
• Evaluar mediante la revisión literaria (artículos científicos) los medios de cultivos a utilizar y los parámetros de incubación de la planta.
• Identificar métodos de desinfección más efectivos para las orquídeas

• Hipótesis

• Si realizamos una revisión literaria efectiva y establecemos los parámetros de crecimiento y las etapas de micropropagación de las orquídeas (catleya) podríamos obtener un tejido sano y libre de contaminación.

• Puntos importantes sobre la introducción delineando el problema.

• Esta suele ser una planta con muchos géneros y una amplia variedad de especies.  Depende de la especie es una planta que puede tener un solo brote y tardarse años en volver procrear. Necesita parámetros de humedad específica y fotoperiodos. En etapas de explante y adaptación pueden aparecer compuestos fenólicos y variaciones somacloniales.

Protocolo de Orquidea (Cattleya) desde inicio, transferencia hasta Multiplicación:

• Preparación del medio

• Pesar 39.5g (7.9g cada 100 ml) de Knudson C Modified Plus Orchid Medium de Phytotech laboratory (K 425)
• Pesar 20g de D- Sucrose de Phytotech laboratory (S 391)
• Pesar 37.5g de Agar de Phytotech laboratory (A 296)
• En una probeta de 1,000 ml, se agregan 500 ml de agua destilada
• Se agregan los componentes ya previamente pesados en la probeta con el agua destilada.
• Agitar un poco la probeta para mezclar los componentes
• Se colocará en un Hot Plate, una botella de 2,000 ml
• Luego de haber agitado, se agrega el contenido a la botella de 2000 ml
• Con pequeñas cantidades de 100ml de agua destilada se limpia la probeta que contenía el medio hasta recuperar todo el contenido
• Llevar a volumen de 1,000ml de solución, se agrega el agitador magnético por 5 minutos
• Medir pH y equilibrarlo entre 5.6 y 5.8 (Utilizar para ajustar pH, KCL para bajar y NaCl para subir)
• Calentar a una temperatura de 350º (No dejar hervir) hasta que el medio se vea grisáceo
• Se agregan 25ml de medio en un envase (Gerber)
• Repetir el paso hasta que se acabe el liquido
• Finalmente, se esteriliza el medio en el Autoclave a una temperatura de 121º C por 20 minutos

• Esterilización de los materiales:

• Colocar los utensilios a usarse en aluminio, en bolsas azules o en bolsas específicas para autoclavear.
• Ponerle cinta adhesiva especialmente para autoclavear.
• Colocarlos en el autoclave ya sea en canastas o individualmente dejando especio entre ellas para que pase el vapor entre ellas.
• Asegurarse que tenga la cantidad de agua necesaria.
• Poner en modo de materiales a esterilizar 121 C, 15 PSI por 15 minutos.
• Esperar que la presión y temperatura bajen para poder abrir el autoclave.

• Observaciones:

• Utilizar guantes de seguridad para coger los materiales previamente esterilizados.
• Dejar enfriar para utilizarlo el siguiente día.

• Preparación del área de trabajo:

• Dentro del área de trabajo se utiliza el “Laminar Hood” el cual provee al técnico el flujo de aire necesario para poder estar lo más esterilizado al momento de estar trabajando con cultivo de tejido.

• Observaciones:

• Limpiar antes y después de encender el flujo de aire laminar con alcohol al 70%.
• Colocar los objetos en el laminar.
• Después de terminado dejar todo limpio y libre de materiales contaminantes.

• Selección del explante:

• Seleccionar una capsula de la planta preferiblemente verde y no muy madura.
• En caso de que la capsula este muy madura y haya empezado a abrirse es mejor terminar de abrir la capsula y retirar las semillas en un papel.        

• Observaciones:

• Se debe escoger una planta en buenas condiciones, preferiblemente que haya sido regada con agua embotellada durante su crecimiento.
• Tener cuidado con las semillas ya que son muy pequeñas y se pueden dispersar fácilmente
• Colocar las semillas en una bolsa de papel y nunca en una bolsa plástica.

• Desinfección capsula verde cerrada:

• Seleccionar una capsula a desinfectar de la planta madre
• De la capsula retirar los restos de la flor
• Lavar la capsula bajo la pluma retirando los restos de tierra con un cepillo delicado sin dañarla
• En la cámara de flujo laminar realizar la desinfección sumergiendo la capsula en un tubo con cloro 10% por 10 minutos
• Posteriormente sumergir la capsula en alcohol puro, flamear o pasar por el fuego la capsula unos 2 segundos.
• Una vez flameada la capsula está lista para la etapa de inicio

• Observaciones:

• Agitar constantemente el tubo para no retrasar el proceso de desinfección, también como el de enjuague
•  Si al seleccionar la capsula se observa que la misma está abierta, se debe realizar un proceso de desinfección a las semillas

• Desinfección capsula abierta:

• Seleccionar la capsula abierta
• Cortar papel de filtro unos 2 o 3 centímetros cuadrados y formar un sobre
• Colocar una pequeña cantidad de semillas dentro del sobre y cerrarlo utilizando grapas
• Colocar el sobre con una pinza en agua destilada estéril y agitar suavemente 5 minutos
• Posteriormente utilizando las pinzas se transfiere el sobre a una solución de cloro 2%, además añadiendo una gota de tween 20%
• Dejar y agitar unos 10 minutos en la solución para que todas las semillas entren en contacto con el desinfectante
• Retirar el sobre y realizar 3 lavados consecutivos con agua destilada para eliminar el resto de desinfectante que haya quedado sobre las semillas

• Procedimiento Cultivo de tejido:

• Tomar un escarpelo estéril y realizar cortes longitudinales a la capsula
• Flamear el tope del envase (Gerber)
• Retirar semillas de la capsula dispersándolas sobre el medio de cultivo.
• Cerrar el envase donde se ha realizado el cultivo de las semillas
• Sellar con papel parafilm
• Llevar el cultivo a la sala de crecimiento con una humedad entre 65 y 70%  a una temperatura de 24º C
• El fotoperiodo o exposición a la luz, debe ser 16 horas de luz (1350 Lux de intensidad) y 8 de oscuridad

• Etapa Transferencia y Multiplicación:

• Preparación del medio

• Pesar 39.5g (7.9g cada 100 ml) de Knudson C Modified Plus Orchid Medium de Phytotech laboratory (K 425)
• Pesar 30g de D- Sucrose de Phytotech laboratory (S 391)
• Pesar 37.5g (0.75g cada 100ml) de Agar de Phytotech laboratory (A 296)
• Pesar 1.0g de BAP (6 – benzilaminopurina)
• Pesar 1.0g de AIA (Auxinas)
• En una probeta de 1,000 ml, se agregan 500 ml de agua destilada
• Se agregan los componentes ya previamente pesados en la probeta con el agua destilada.
• Agitar un poco la probeta para mezclar los componentes
• Se colocará en un Hot Plate, una botella de 2,000 ml
• Luego de haber agitado, se agrega el contenido a la botella de 2000 ml
• Con pequeñas cantidades de 100ml de agua destilada se limpia la probeta que contenía el medio hasta recuperar todo el contenido
• Llevar a volumen de 1,000ml de solución, se agrega el agitador magnético por 5 minutos
• Medir pH y equilibrarlo entre 5.6 y 5.8 (Utilizar para ajustar pH, KCL para bajar y NaCl para subir)
• Calentar a una temperatura de 350º (No dejar hervir) hasta que el medio se vea grisáceo
• Se agregan 25ml de medio en un envase (Gerber)
• Repetir el paso hasta que se acabe el liquido
• Finalmente, se esteriliza el medio en el Autoclave a una temperatura de 121º C por 20 minutos

• Observaciones:

• Se utilizará el mismo procedimiento que se utilizó para realizar el medio de cultivo en la etapa de iniciación, en adición a lo ya establecido se le añadirá 1.0g de BAP (6 – benzilaminopurina) Hormona de crecimiento y 1.0g de AIA (Auxinas) y se aumentará la cantidad de sucrosa a 30g

• Tejido

• Se desinfecta el Laminar con alcohol 70% 15 minutos antes de comenzar el proceso de multiplicación
• Introducir materiales (Mechero, frascos de agua destilada, papel azul, 3 pinzas y “stand”)
• Los contenedores con las orquídeas que han estado en el cuarto de crecimiento se rocían con alcohol 70% y se introducen al laminar
• Se procede a quitar el papel parafilm a los envases de Gerber y se mantienen cerradas las muestras hasta que se vaya a remover el tejido del medio
• Utilizando pinzas previamente esterilizadas separamos el tejido del medio y se remueven los residuos del medio con agua destilada, dejar reposar los tejidos en el papel azul.
• Utilizando las técnicas asépticas, introducir los tejidos en los nuevos medios de cultivo modificados.

• Observaciones:

• Después de flamear y tapar el Gerber se sella con parafilm
• Identificar el nuevo Gerber con la fecha de iniciación previa y la fecha del día del día de transferencia.
• El traslado de un medio a otro en la etapa de multiplicación, varía de una especie a otra. Para la primera multiplicación se debe observar la formación de plantas, y que cubra en su mayoría el espacio del contenedor
• El número de subdivisiones se repite cuantas veces sea necesario sin dañar la estabilidad genética del cultivo.

• Condiciones de incubación:

• Llevar el cultivo a la sala de crecimiento con una humedad entre 65 y 70% a una temperatura de 24º C
• El fotoperiodo o exposición a la luz, debe ser 16 horas de luz (1350 Lux de intensidad) y 8 de oscuridad

• Enraizamiento:

• Medio de cultivo

• En esta etapa no se realiza otro medio de cultivo distinto, porque durante la fase de multiplicación se han ido presentando formación de raíces.
• Del proceso de multiplicación, se lleva directamente al proceso de endurecimiento y adaptación. Siempre y cuando el tejido se encuentre sano y libre de contaminación.

• Endurecimiento y Adaptación:

• Las plantas serán transferidas a las condiciones del exterior cuando alcancen una altura de 1-4 cm, y con las raíces bien desarrolladas.
• Las raíces se lavan con agua tibia hasta eliminar los residuos del medio; luego se vuelven a lavar con agua estéril y se han dejado reposar por 5 minutos.
• El sustrato de adaptación consiste de dos capas, una superior de musgo natural comercial y una capa inferior piedra pómez esterilizada en autoclave por 1 hora a 15PSI a temperatura de 121°C.

• Bibliografia:

• Arditti, J, & R. Ernst. 1993. Micropropagation of Orchids. John Wiley &Sons, Inc. Canada
• Seaton, p. & ramsay, M. 2009. Cultivo de orquídeas por semilla. Royal Botanic Garden Kew. England.
• Vásquez, Ch.,R. & P. L. Ibisch. 2004. Orquídeas de Bolivia / Orchids of Bolivia. Diversidad y estado de conservación/ Diversity and conservation status. Vol II. Subtribu: Pleurothallidinae. Editorial FAN., Santa Cruz de la Sierra, Bolivia.
• Arditti, J. 1982. Orchid seed germination and seedling culture - A Manual. En J. Arditti (Ed.) Orchid biology: reviews and perspectives II. Págs. 243-370. Cornell University Press, Londres.
• Pritchard, H.W. (Ed.) 1989. Modern methods in orchid conservation: The role of physiology, ecology and management. Cambridge University Press, Cambridge.
• Thompson, P.A. 1980. Orchids from seed. HMSO, Londres.
• Navalinskienel, M., J. Raugalas, M. Samuitienel, 2005. Viral diseases of flower plants:16. Identification of viruses affecting orchids (Cymbidium Sw.). Biologia, 2, 29-34.
• Lawson, R.H., H.T. Hsu, 1995. Orquids, p. 409-420. In: Loebenstein, G., R.H. Lawson, A.A. Brunt (eds.). Virus and virus like diseases of bulb and flower crops. Wiley-VCH Verlag GmbH & Co., 556 pp.
• Hazarika, B.N., 2003. Acclimatization of tissue cultured plants. Curr. Sci. 85, 1704– 1712
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