Biología Molecular, extracción de ácidos nucleicos
Enviado por Amira Plata Andrade • 6 de Octubre de 2021 • Documentos de Investigación • 765 Palabras (4 Páginas) • 223 Visitas
BIOLOGÍA MOLECULAR
EXTRACCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS
- Objetivo
- El objetivo que se busca con la realización de esta práctica es la extracción de material genético de células epiteliales, con una calidad y una cantidad considerable para su posterior análisis en el laboratorio de biología molecular, por medio de técnicas que ayuden a lisis, purificación, precipitación y rehidratación de los ácidos nucleicos extraídos.
- Fundamento teórico
Extracción de ADN
- Proceso de liberación del material genético contenido dentro de una célula.
- Los ácidos nucleicos son separados de los componentes celulares, así como de proteínas que contienen las células.
[pic 1]
[pic 2]
Pasos para la extracción de ácidos nucleicos:
Tampón TEN
Los tampones se utilizan en cualquier trabajo bioquímico para mantener la estabilidad del pH. Esto es especialmente cierto cuando se extrae cualquier molécula de una célula porque la lisis está involucrada donde el pH puede cambiar drásticamente y esto podría tener un efecto despectivo sobre la molécula diana. En el caso de la extracción de ADN, se suele utilizar tampón TEN. TEN contiene Tris-HCl 40 mM, pH 7,5 - 8,0, EDTA (ácido etilendiaminotetraacético) 1 mM y NaCl 150 mM. Tris-HCl es el tampón y es éste el que evita cambios en el pH por neutralidad. El EDTA es un agente quelante y se unirá a cationes divalentes. Esto inhibirá enzimas como las nucleasas que pueden degradar el ADN. Se agrega cloruro de sodio para ayudar a neutralizar la carga negativa en el ADN, haciéndolo menos hidrófilo, menos soluble en agua. Esto ayuda a su precipitación cuando se agrega alcohol en una etapa posterior. También afecta a las proteínas, lo que facilita su precipitación en una etapa para separarlas del ADN, generalmente cuando se agrega un detergente.
Lisis celular
Tritón X100: Detergente para desorganizar las membranas biológicas, permitiendo la ruptura de las mismas.
Tris: Este es un compuesto básico (2-amino-2-(hidroximetil)-1, 3- propanodiol) para la preparación de diversos tampones, y como agregado en reactivos de lisis, purificación, y resuspensión de ácidos nucleicos.
Ruptura de la pared celular
Componentes para lisar la célula
Tris: éste es un compuesto básico (2-amino-2-(hidroximetil)-1, 3- propanodiol) para la preparación de diversos tampones.
EDTA: Es el ácido etilendiaminotetraacético, y generalmente se provee en forma de sal disódica. Está incluido en muchos buffers de extracción para quelar cationes divalentes tales como Mg2+ o Ca2+, los cuales son cofactores de enzimas que degradan el ADN. Sin embargo, existe una ADNasa que es estimulada por EDTA.
Cloruro de Sodio: Las sales se agregan para fines de estabilizar el medio salino y además para coadyuvar a la lisis de las paredes celulares vegetales o a las membranas biológicas en caso de las muestras de tejidos. Las sales aumentan el poder iónico de la solución y ocasionan la precipitación de ADN. Se ha observado que concentraciones más elevadas de este compuesto pueden ayudar a la eliminación de polisacáridos.
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