Bitácora de Biología Molecular

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Índice

Practica 1 extracción de ADN

Introducción

Para que el ácido nucleico (AN) pueda ser manipulado este debe extraerse ya sea de un organismo o de células específicas. Hay diferentes técnicas que permiten obtener ácidos nucleicos con alto grado de pureza. Las más utilizadas suelen incluir una etapa de ultracentrifugación en gradientes de CsCl o una cromatografía de intercambio iónico. Sin embargo, muchas aplicaciones de laboratorio no necesitan un grado de pureza tal que justifique incluir estas técnicas (laboriosas y/o caras) en los protocolos de purificación. Uno de los método más utilizados para extraer y purificar ácidos nucleicos utiliza fenol para extraer AN en pequeña o grande escala. La función principal del fenol es remover las proteínas de la solución. Las etapas para extraer AN consisten en:

1. Desintegración del tejido y solubilización y homogenización de los componentes celulares.

2. Precipitación de los ácidos nucleicos y disolución en un buffer adecuado.

Homogenización de la muestra

El método para desintegrar el tejido debe estar adaptado a las características de éste. Para grandes volúmenes de tejidos blandos, suelen usarse licuadoras esencialmente iguales a las licuadoras domésticas. Para volúmenes menores, en general es suficiente un homogeneizador, el cual consiste en un tubo de vidrio de paredes gruesas y un pistón (de vidrio o de teflón). La rotación del pistón dentro del tubo (propulsión manual o por un motor), disgrega la muestra. Tejidos más resistentes, como por ejemplo hueso o diente, necesitan tratamientos mecánicos especiales. Aquellos tejidos con células cuya pared celular es resistente, como por ejemplo vegetales,hongos o bacterias, requieren también condiciones drásticas. Uno de los métodos más utilizados consiste en congelar la muestra en nitrógeno líquido y, manteniéndola congelada, pulverizarla con un mortero. Así, además de desintegrar la muestra, se logra que ésta se mantenga a muy baja temperatura durante el tratamiento, con lo cual se evita la acción de nucleasas endógenas que pudieran degradar el material de interés. se han descrito diversos métodos particulares a cada tipo de muestra. Por ejemplo, en  el caso particular de células bacterianas, se emplea típicamente la enzima lisozima, que  cataliza la degradación de la pared celular. Para facilitar a la solubilización de los  componentes celulares, y a la ruptura de membranas y complejos proteicos, la solución  de lisis contendrá un detergente iónico (dodecil sulfato de sodio, SDS). Este detergente  dispersa los componentes de las membranas y desnaturaliza las proteínas. La solución  de lisis contiene además el agente quelante de cationes divalentes EDTA. Esto impide la acción de las ADNasas (dependientes de Mg++), aunque no tiene efectos sobre la  mayor parte de las ribonucleasas.

Extracción de proteínas y lípidos

Los ácidos nucleicos son muy solubles en agua debido al fuerte carácter hidrofílico de sus grupos fosfato. Dentro de una mezcla de solventes no miscibles, uno  acuoso y otro orgánico no polar, los ácidos nucleicos tenderán a permanecer en la fase acuosa, en tanto que los lípidos y gran parte de las proteínas desnaturalizadas se encontrarán en la fase orgánica. En la preparación de ácidos nucleicos, los solventes que se usan más frecuentemente para la extracción de proteínas y lípidos son el fenol y el cloroformo.

Precipitación de ácidos nucleicos.

La precipitación de los ácidos nucleicos permite su purificación y concentración. Se basa en la simultánea neutralización de las cargas negativas (mediante el añadido de sales), y deshidratación de la molécula (mediada por el agregado de alcoholes, típicamente etanol o isopropanol), lo cual lleva a su precipitación. La precipitación es un fenómeno reversible (mediante la disolución en soluciones acuosas) y no debe ser confundido ni con la desnaturalización (potencialmente reversible) ni con la degradación (irreversible) de los mismos.

Objetivos

•  Que el alumno extraiga ADN de diferentes muestras por métodos físico-químicos
• Conocer la metodología básica para la extracción de ADN
•  Adquirir destreza en la manipulación de diversas muestras biológicas para la extracción de ADN

Metodología

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Resultado

Conclusión y Discusión

Bibliografía

Práctica 2: Extracción de RNA

Introducción

En las células tanto eucariotas como procariotas existen diferentes tipos ARN, los principales son ARNm (ARN mensajero), ARNt (ARN de transferencia) y ARNr (ARN ribosomal) siendo este último el más abundante en la célula. Cuando se realiza una extracción de ARN total se extraen los diferentes tipos de ARN sin embargo cuando se visualiza su integridad en un gel de agarosa, el único ARN visible es el ribosomal por ser el más abundante. El ribosoma eucariótico es denominado 80S por su coeficiente de sedimentación y está compuesto por dos subunidades, la subunidad mayor 60S que está compuesta por las subunidades 5S, 28S y 5.8S y la subunidad menor 40S compuesta por la subunidad 18S. El ribosoma procariótico es denominado 70S y está compuesto por las subunidades mayor 50S conformada por las subunidades 5S y 23S; y la subunidad menor 30S compuesta por la subunidad 16S. En el gel de agarosa el ARN que se observa es el de las subunidades 28S y 18S en el caso de eucariotas y las subunidades 23S y 16S en las extracciones provenientes de células procariotas. En algunos casos se puede llegar a observar la banda correspondiente a ARNm la cual se observa como una serie de bandas difusas.

El aislamiento de ARN intacto de las células es esencial para experimentos en los cuales se analizan niveles de transcripción así como también el análisis del metabolismo del ARN. El principal problema en las extracciones de ARN es que la mayoría de las ribonucleasas (también conocidas como ARNasas) son muy activas y estables y no requieren de ningún co-factor para funcionar. Por esta razón, el primer paso en las extracciones de ARN es lisar (con la ayuda de detergentes) a la célula condiciones desnaturalizantes para las ribonucleasas. El dietílpirocarbonato o DEPC es un potente inactivador de las ribonucleasas y es ampliamente utilizado en las extracciones de ARN, reacciona con las enzimas que contienen grupos –NH, -OH o –SH en su sitio activo.  Posteriormente el ARN es separado del resto de las macromoléculas mediante el uso de NaCl el cual co-precipita con el detergente, las proteínas y el ADN. Una vez separados mediante centrifugación, el ARN es el componente principal del sobrenadante obtenido y este es precipitado con la ayuda de etanol. Debido a la estabilidad de las ARNasas es muy importante que se evite cualquier fuente de contaminación, por lo que se recomienda siempre el uso de guantes y material limpio tratado con productos inhibidores de las ribonucleasas, particularmente en el paso final, cuando las muestras están siendo preparadas para su almacenamiento.

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