Hidroxilamina como agente mutagénico para NeurosporaCrassa

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Hidroxilamina como agente mutagénico para NeurosporaCrassa

Resumen

La mutagenicidad de Hidroxilamina (HA) ha sido probada en 8 diferentes mutantes de Neurosporacrassa, auxótrofas a Adenina (ad-3B):

4 mutantes de este set de prueba se revirtieron después del tratamiento con ácido nitroso y metanosulfonato de etilo, indicando que estos se revirtieron por una substitución de un par de bases;2 mutantes se revirtieron solo después del tratamiento con ICR-170, indicando que estos se revirtieron por una inserción o deleción de un par de bases; y 2 mutantes se revirtieron solo espontáneamente.

La HA indujo reversiones en 3 de los 4 mutantes, los cuales se revirtieron por la sustitución de un par de bases y en ningún otro. La especificidad de acción de HA en los mutantes en el presente set de prueba es consistente con la hipótesis de que la clase predominante de las alteraciones genéticas inducidas por HA en Neurosporacrassaes la transición de un par de bases, de Guanina-Citosina a Adenina—Timina. Además se encontró que la frecuencia de reversión después del tratamiento con HA aumentó en proporción al cuadrado del tiempo del tratamiento.

Introducción

HA induce una sustitución de un par de bases en fagos y el tipo de alteración genética es preferentemente de G-C a A-T. La reacción química entre HA y DNA ha sido analizada por FREESE et al, quien encontró que HA reacciona solo con citosina y HMC. El tratamiento de RNA con HA altera ambos: Uracilo y Citosina; a pH=6.1 la reacción es mucho más rápida con Citosina que con Uracilo, mientras más alto el pH, la relación es a la inversa. HA ha mostrado inducir daño cromosomal en células de mamíferos, pero ningún ensayo previo ha sido exitoso en identificar las alteraciones genéticas inducidas por HA en eucariotes a nivel molecular. La caracterización de mutaciones en Neurospora inducidas por HA es particularmente importante porque podría ser tan específico en eucariotes como en fagos, produciendo mutaciones por sustitución de par de bases, resultando en transiciones de GC a AT. Tal especificidad podría hacer a HA especialmente idónea  para la caracterización de alteraciones genéticas inducidas por mutágenos menos específicos a nivel molecular por el significado de las pruebas para reversibilidad específica. La prueba para la inducción de reversiones en mutantes resultantes de alteraciones genéticas conocidas es un método más simple para caracterizar los efectos genéticos de mutágenos que ninguna técnica conocida que se aplique después de la mutación en Neurospora. La caracterización estálimitada por la colección de alteraciones genéticas en el mutante que comprende este set de prueba. Sin embargo, seleccionando el revertimiento de mutantes por las alteraciones genéticas más comunes es posible obtener una aproximación del espectro de alteraciones genéticas producidas por un mutágeno dado.

En este documento un set de prueba de mutantes ad-3B formado por 4 mutantes los cuales se reviertieron solo por la sustitución de un par de bases, 2 mutantes que se revirtieron solo por la inserción o deleción de un par de bases, y 2 mutantes los cuales se revirtieron solo espontáneamente donde estos se trataron con HA y después proyectados para detercar reversiones al tipo solvestre. Los resultados de esta prueba muestran claramente que en HA produce reversión en aquellas cepas de Neurospora que se revirtieron por una sustitución de un par de bases. La especificidad de acción de HA en los mutantes en el presente set de prueba es consistente con la hipótesis de que la clase predominante de alteraciones genéticas inducidas por HA en Neurospora es una transición de un par de bases, de GC a AT.

Materialesy métodos

1. Cepas

Los mutantes con el prefijo 2-17 fueron inducidos por ácido Nitroso en la cepa de Neurospora del tipo silvestre 74 A. El mutante No. 5-4-I es de origen espontáneo. Los mutantes han sido aislados por el método directo.

1. Preparación del cultivo

En todos los experimentos el tratamiento mutagénico fue llevado a cabo en suspensión de cosecha de conidios, de matraces Erlenmeyer de 125ml con 20ml demedio completo de glicerol (10ml glicerol/l en lugar de 20ml) mas Sulfato de Adenina (25mg/L).
Los matraces fueron inoculados y después incubados por 1 día a 30 C  y después de 6-9 días a 25 C, los conidios fueron cosechados primero agitándolos con perlas de vidrio (4mm de diam) para romper las cadenas de conidios, después fueron suspendidos en solución salina (0.9%) filtradas a través de un colador de platino, lavados 2 veces por centrifugación y luego resuspendidos en solución salina, los mutantes Ad-3 difieren entre ellos con respecto al desarrollo del pigmento purpura en el micelio y conidios cuando crece en medio completado con glicerol, pero al añadir 250 mg de Sulfato de Adenina/L la acumulación de pigmento purpura es eliminado.
La densidad de la suspensión de conidios fue medida en un colorímetro en el pico de absorción de 750mμ.

1. Tratamiento

Todos los tratamientos fueron llevados a cabo con suspensión de conidios en matraces Erlenmeyer en un agitador rotatorio en baño de agua a 25 C para mantener a los conidios en suspensión durante el tratamiento. 5 minutos antes de finalizar el tratamiento los conidios fueron centrifugados y el sobrenadante fue decantado. Al momento del enfriamiento después del tratamiento con cualquiera de los agentes: NA, EMS o ICR-170, los conidios fueron resuspendidos en una solución salina (minimo de Frie´s) ajustado a pH 8 con NaOH.
Este procedimiento se realizó por duplicado.

La solución de sal mínimo de FRIE´s ajustado a pH se ha usado para determinar inmediatamente la reacción entre células y compuestos alquilantes y NA.

1. Tratamiento con NA

Los conidios fueron suspendidos en Acetato de sodio 0.05M buffer a pH 4.5. Un volumen de preparado fresco de solución de Nitrato de sodio a 0.02M fue añadido a 3 volúmenes de conidios. La concentración final de NaNO2 fue de 0.005M y el tratamiento fue finalizado como se describe anteriormente 40 min después de iniciar el tratamiento

1. Tratamiento con EMS

Los conidios fueron suspendidos en buffer de Fosfato a 0.067M a pH de 7. El tratamiento se comenzó añadiendo suficiente EMS para llegar a la concentración final 0.1M, el tratamiento suspendido 300 min después

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