METODOLOGÍA EXPERIMENTAL EN EL ESTUDIO DEL DESARROLLO CRANEOFACIAL

METODOLOGÍA EXPERIMENTAL EN EL ESTUDIO DEL DESARROLLO CRANEOFACIAL 

Embriología experimental en el estudio del desarrollo del paladar y de los mecanismos productores de la fisura palatina

1. Histología convencional

Todo parte de un tejido muerto fijado con un determinado Fijador como Formaldehido y Paraformaldehido normalmente al 10%.  

• Objetivo: analizarla morfología interna de una estructura.
• Pasos:

1. Lavado con agua corriente.
2. Deshidratación (alcoholes)
3. Aclaramiento. Meterlo en un liquido miscible (SILENO) con parafina pq los alcoholes no son miscibles.
4. Inclusión en parafina(tb en plástico u otros) , la parafina suele estar líquida a >40ºC. EN función del volumen de la pieza se mantienen un tiempo determinado.
5. Extraccion de la parafina con  la pieza→ bloque de la pieza embebida en parafina.
6. Corte con micrótomo→ obtenemos secciones.
7. Desparafinas.
8. Hidratas→ son soluciones en agua , no podemos pasar de sileno a la tinción, con determinados tiempos vamos hidratando la fórmula.
9. Tinción (10micras, no muy finos) .
10. Deshidratación
11. Montaje de la muestra en cubreobjetos→ conservación de la muestra.

• ¿Qué se ve?

• Da información morfológica, analizando los tejidos. Pero no se sabe el pq se ha producido una malformación o no.

1. Inmunohistoquímica

Analizar la presencia y localización de moléculas en un tejido. Las  q están o no están en los tejidos, las q debería estar…

• ¿En que se basa? En la reacción antígeno-anticuerpo. ( la unión del anticuerpo con el antígeno se lleva a cabo a través de su región variable o cadenas ligeras).

• Epitopos: no hablamos de antígenos. Ej: quiero saber si el tejido con el q trabajo tiene fibronectina (pq es imp para la adhesión de los tejs ) y quiero saber si tienen disminución de la fibronectina.. Compro el epitopo (fibronectina) y un anticuerpo q se pueda visualizar(lligado a HRP o peroxidasa del rábano picante q con un sustrato adecuado da color).  Vere si hay color. Cuando haga el estudio. Si hay color habrá mas Fibronectina y menos color menos fibronectina.

• Pasos: tendrás q realizar pasos anteriores con la muestra de ratón aunq depende de  q epítopo hayas usado, necesitaras diferentes medios dnd incluir tu muestra.

1. Inmunización de conejo con fibronectina de ratón (comercial)→ IgG de conejo antifibronectina de ratón.
2. Procesado del tej de ratón (especifico)
3. Incubación con el anticuerpo 1º (IgG conejo)
4. Incubación con el anticuerpo 2º (de cabra: anti IgG de conejo), después de lavar tras el 1º.
5. Incubación con sustrato (DAB) para verlo.
6. Deshidratación y montaje.

1. Hibridación in situ

Detección de mRNA→ para saber si un gen se está expresando. Puedo tener una proteína pero no se si el gen q la produjo se expresó hace 3 horas o se está expresando en este momento.

• Uso en embriología: importante conocer si una alteración se produce pq falta un gen o si es pq está deteriorado.
• PASOS: Pones una serie de nucleótidos marcados ( para poder verlos) complementarios al gen  q quieres demostrar con una secuencia determinada ( eso se compra  o se pide). Esto se denomina SONDA. Queremos q una secuencia de nucleótidos (del mRNA del gen q queremos investigar) se acople a nuestra muestra.  Si esta el mRNA  significa q el gen se está expresando en ese momento.

IMPORTANTE Q NO HAYA RNAsas!!!  TECNICA TRABAJAR MUY LIMPIO, MUY EN FRIO Y RÁPIDO.

1. Cultivos de procesos palatinos

Te permiten cambar las condiciones → trabajas como quieres.

• Pasos

1. Poner las ratas reproducción→ conseguir preñadas
2. A las 13 semanas→ sacrificamos. Abrimos cuernos uterinos.
3. Metemos embriones en placa Petri, no tocar liquidos…
4. Corte de cabeza. Corte de mand y lengua→ visión intrabucal de procesos palatinos. Extraccion de procesos palatinos.  Dejamos fragmento de la mand para conocer el genotipo (++/--) del embrión. Cada cabeza va a un pocillo para determinar posteriormente el genotipo.(técnica PCR).
5. Se ponen los procesos palatinos en una placa de cultivo,. En el centro de la placa hay medio de cultivo, y  una rejilla . Encima de la rejilla ponemos un papel y encima los procesos palatinos.

RATONES NEGATIVOS PARA TGF BETA 3

Genotipo: ++ → silvestre /--→ negativo  o mutante/ +-→heterocigotos.

Día 15 de gestación se observa:

Raza c57

1. Silvestre: presenta paladar primario y secundario y zona perfecta de fusión.
2. Mutante:  Presenta fisura palatina completa.

Raza MF1

1. Mutante: Presenta fisura palatina no completa. Una anterior y una posterior. Deben adherir mejor q los de otra raza.

A medida q el ratón crezca se observará mayor separación de las fisuras palatinas.

¿Como se consiguen ratones mutantes para un gen? ( lo hacen las casas comerciales, nosotros compramos los ratones mutados)

1. Mutación del gen y amplificación del gen en bacterias. Exon: parte del gen q codifica secuencias del dominio activo de TGF beta3. De esa parte el ARN mensajero codificará la proteína TGF beta 3.

1. Producción del vector: Insertan en ese exón diferentes genes

1. Gen de resistencia a neomicina: neor
2. Gen de la timidina kinasa de un herpes virus.

1. Pones en contacto los vectores dentro de la cla del ratón, pueden ocurrir dos cosas:

1. Proceso de recombinación homólogo: tienes un gen y le pones al lado un vector→ hay una recombinación del gen.  El vector de resistencia a neomicina se integra en el gen del ratón q codifica para TGFBETA3   y se pierde el de resistencia a la timidina-kinasa. → expresión de mRNA anormal→ proteína anormal→ no funciona. EL gen se bloquea. CLAS ROSAS
2. Inserción al azar: se inserta el vector en el cromosoma al azar. El gen conservará ambos genes: el de resistencia a neomicina y de la timidina kinasa→ lo mas fácil q no se exprese pq no tiene promotor.CLAS GRISES
3. No inserción: no se inserta el vector. CLAS BLANCAS

1. Quieres tener clas rosas (a) → quieres eliminar aquellas que no tienen el gen de la resistencia y q tienen el gen de la timidina.  Para ello echas análogo a la neomicina→ se eliminan todas las clas q no tienen el gen de la resistencia a la neomicina (BLANCAS).  Después echas un antiviral  q elimnia las clas q tienen el gen de la timidina-kinasa ( GRISES).

1. Te quedan clas ROSAS: con gen de rla resistencia a la neomicina y q no tienen gen de la timidina kinasa.

1. Se cogen dos razas de ratón:

1. Hembra: dominante del egn agouti q hace q el pelo del ratón sea marrón.  Sacamos las  clas ROSAS con el VECTOR Q queremos del ratón marrón.  
2. Hembra: sacamos blastocisto de ratón de pelo negro son gen agouti.
3. Unimos clas ROSAS del raton marrón+ blastocisto del ratón negro.

Implantamos blastocisto QUIMERA ( clas de dos razas distintas)  en “madre de alquiler”: ratón.

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