PROTOCOLO DE INVESTIGACIÓN PARA LA PRODUCCIÓN DE FITOHEMAGLUTININA (PHA)

UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO[pic 1][pic 2]

FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES CUAUTITLÁN

DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

LICENCIATURA EN BIOQUÍMICA DIAGNÓSTICA

PRODUCCIÓN Y CONTROL DE BIOLÓGICOS

GRUPO 2001

PROTOCOLO DE INVESTIGACIÓN PARA LA PRODUCCIÓN DE FITOHEMAGLUTININA (PHA)

ALUMNAS:

Hernández Covarrubias Larisa Olivia

Reyes Alvarez Lourdes

ASESORES:

Dr. Víctor Vázquez

M. en C. Arianna Romero

Fecha: 26 de febrero del 2018

1. INTRODUCCIÓN

Dentro de las fitolectinas o lectinas de las legumbres o los cereales, que como familia muchas de ellas comparten también la propiedad de inducir mitosis en algunos tipos de células; se encuentra la lectina de la semilla del guisante, la lectina de la lenteja, la aglutinina del frijol de soya, la aglutinina del germen del trigo, el mitógeno de la hierba carmín, la aglutinina del maní, la concanavalina A y la fitohemaglutinina (PHA, siglas en inglés), entre otras . De todas ellas una de las más estudiadas y una de las que mayor interés despierta en investigaciones es la fitohemaglutinina por la amplia gama de aplicaciones que se le atribuyen.

La fitohemaglutinina (PHA) se obtiene a partir de diferentes variedades de frijol pertenecientes a la especie Phaseolus vulgaris. Es una proteína que presenta una potente actividad mitogénica que también es capaz de aglutinar distintos tipos de células, tales como eritrocitos y leucocitos. (Hernández, P., González, O., Rodríguez, Y., & Ganen, C.. 1999)

El frijol colorado (Phaseolus Vulgaris) es una planta anual, herbácea intensamente cultivada desde la zona tropical hasta las templadas. Es originario de América y se le conoce con diferentes nombres: poroto, haricot, caraota, judía, aluvia, habichuela y otros. El frijol es uno de los alimentos básicos en la dieta del mexicano y es la principal fuente de proteína; es rico en lisina pero deficiente en los aminoácidos azufrados metionina, cistina y triptófano; por lo cual una dieta adecuada en aminoácidos esenciales se logra al combinar frijol con cereales (arroz, maíz, otros). (Barrera, Lemus, 2016)

La PHA se acumula, sobre todo, en las vacuolas de almacenamiento del parénquima de los cotiledones de las semillas, pero también se concentra en las raíces de la planta, específicamente en las vacuolas de los meristemas de las raíces primarias y en las paredes celulares de las raíces elongadas. (Hernández, P., González, O., Rodríguez, Y., & Ganen, C.. 1999)

La PHA está constituida por una mezcla de 5 isolectinas tetramétricas (L4, L3E, L2E2, LE3 y E4) con propiedades biológicas diferentes, las cuales están formadas por varias combinaciones de 2 subunidades L y E. La isolectina L4 tiene una actividad mitogénica y leucoaglutinacion potente, sin embargo, no presenta actividad eritro aglutinante, mientras que la E4 tiene actividad eritro aglutinante muy fuerte pero no muestra actividad leucoaglutinacion. Las isolectinas restantes, L3E2 y LE3, presentan actividad de leucoaglutinacion y eritro aglutinante proporcionales a las cantidades de subunidades E y L. (Hernández, P., González, O., Rodríguez, Y., & Ganen, C.. 1999)

El presente trabajo tiene como objeto extraer la fitohemaglutinina del frijol colorado, a través de una extracción con solución salina para poder purificarla y envasada y que pueda ser utilizada en un futuro para investigaciones científicas.

2. JUSTIFICACIÓN

La Fitohemaglutinina es una proteína tipo lectina, ampliamente distribuida entre las legumbres de uso común en México, que se aísla principalmente del frijol rojo Phaseolus vulgaris, y funciona principalmente en los fenómenos de reconocimiento de receptores de membrana a carbohidratos, tanto a nivel molecular como celular. Es un producto biológico, clasificado dentro de los mitógenos más utilizados, por su propiedad de estimular la producción de linfocitos de células T CD4. (Moore, 2001).

La Fitohemaglutinina está formada por dos dominios, uno tipo lectina y otro regular, lo que le da la capacidad de aglutinar eritrocitos, leucocitos, y así estimular la proliferación de linfocitos T.

La Fitohemaglutinina es un producto biológico natural, de fácil obtención, que su producción a baja y gran escala resulta económica, y, sobretodo, que es ampliamente utilizada en el área biológica de cultivos celulares, por lo que su aplicación es muy importante en el área de las ciencias.

3. OBJETIVOS

        3.1 General

Extraer fitohemaglutinina a partir del frijol colorado (Phaseolus Vulgaris) mediante una extracción con solución salina para poder ser envasado y etiquetado y que pueda ser presentado como un producto biológico.

        3.2 Particulares

• Obtener la fitohemaglutinina a partir de una extracción con solución salina, para después liofilizarla y poder envasarla.

• Envasar y etiquetar la fitohemaglutinina conforme lo indica la norma NOM-072-SSA1-2012, Etiquetado de medicamentos

4. MATERIALES Y MÉTODOS

 4.1 Materiales

1. Biológicos

• 250 gr de Phaseolus vulgaris (frijol rojo)

1. Soluciones

• 500 ml de Solución Salina Isotónica (NaCl 0.85%)
• 300 ml de SSF
• agua corriente

1. Equipo

• Mortero mediano
• balanza analítica
• ultracentrifugadora
• filtros de celulosa 0.02 nm
• papel parafilm
• 2 probetas de 100 ml
• frasco con tapa
• tubos cónicos de 50 ml
• liofilizador
• 3 vasos de precipitado de 100 ml
• jeringa de 2ml.

1. Envasado

• viales de vidrio
• tapas de corcho y aluminio
• etiquetas correspondientes
• cajas de envase primario
• cajas de envase secundario

4.2 Métodos

• OBTENCIÓN DE LA FITOHEMAGLUTININA:

1. Pesar en la balanza analítica 250 gramos de frijol colorado
2. Lavar 250 gr de frijol con agua corriente y dejarlos remojando en vaso de precipitado de 100 ml por 24 hrs a 4°C.

NOTA: cubrir el vaso de precipitado con plástico o papel parafim para evitar contaminación. De no poder dejarlos a 4°c se pueden dejar dentro de la gaveta.

1. Decantar el agua, pelar los frijoles y en caso de que existan frijoles en mal estado separarlos.

1. Disgregarlos con SSF en el mortero hasta llegar a una pulpa fina, realizar varios lavados de la pasta que se forma para tratar de recuperar la mayor cantidad de pulpa posible.

1. Pasar la pulpa a un frasco con tapa debidamente etiquetado y agregar otros 200 ml de SSI.

NOTA: el frasco se debe encontrar totalmente limpio y de ser posible estéril para evitar contaminación.

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