Práctica Determinación de aminoácidos terminales con grupo alfa amino libre

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Introducción

La hemoglobina es una proteína de estructura cuaternaria, que consta de cuatro subunidades. Esta proteína forma parte de la familia de las hemoproteínas, ya que posee 1 grupo hemo en cada subunidad.

La determinación de la estructura primaria de una proteína suele denominarse secuenciación. Frederick Sanger, diseño un método el cual consiste en el marcaje del amino terminal a través del uso de DNFB, este compuesto reacciona con los grupos amino libres en condiciones básicas formando los dinitrofenil derivados, también reacciona con los grupos imidazol, fenólicos y epsiolonoamino por lo que se dará una dinitrofenilación en la cadena lateral de la tirosina, histidina  y lisina. Al hidrolizar el pép8do o la proteína ya dinitrofenilada, se da una ruptura total de los enlaces peptídicos lo que da como resultado un hidrolizado que contendrá aminoácidos libres y DNP derivados que se conservan intactos, y que su enlace es difícil de romper.

Objetivos

Identificar el aminoácido alfa-amino terminal de las cadenas de la molécula de hemoglobina mediante el método de Sanger.

Desarrollo

Se   colocaron   30   mg   de   hemoglobina   en   un tubo y se disolvió con bicarbonato de sodio al 4.2%, debido   a   que   la   reacción   con   el DNFB se lleva a cabo en condiciones ligeramente básicas, para poder desprotonar, manteniendo un pH de 8-9. Después se agregó al tubo DNFB al 1% y se agitó, para que se llevara a   cabo   la   reacción   de   dinitrofenilación, posteriormente se agregó HCL 3N, con la finalidad de detener la reacción   de   dinitrofenilación   y   protonar, después se realizaron 3 extracciones con éter para que se disolviera el reactivo que no reaccionó y de este se desechó el exceso, posteriormente se evaporaron los residuos de éter.

Se centrifugó a 3000 rpm durante 15 minutos, se eliminó  el sobrenadante  después  se agregó HCL 6N para recuperar la proteína y se colocó el tubo en la autoclave a P= 15lbf/in^2 durante 3 horas aproximadamente a 121°C con esto se logró la ruptura de los enlaces

peptídicos de la hemo-globina, obteniéndose un “caldo” de aminoácidos  que   contiene al   amino  ácido n-terminal, mismo que se extrajo con éter, se pasó a una parrilla y se evaporó casi a sequedad, el residuo se disolvió en 0.5 ml de etanol y se aplicó en una tira de papel Whatman junto con otros DNP derivados.

Posteriormente se colocó el cromatograma en una cámara previamente saturada con solvente de ácido cítrico y citrato de sodio 0.1 M a pH de6.4, se saturó durante dos horas y se desarrolló el cromatograma en forma ascendente durante 4 o 5 horas. Finalmente se midió  la distancia correspondiente y se calcularon los valores de RF.

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Fig. 1 Cromatograma

Resultados

Discusión

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