Práctica de Biología Celular: Aislamiento y observación de cloroplastos

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UNIVERSIDAD DE SONORA

DIVISIÓN DE CIENCIAS BIOLÓGICAS Y DE LA SALUD

DEPARTAMENTO DE INVESTIGACIONES CIENTÍFICAS Y

 TECNOLÓGICAS DE LA UNIVERSIDAD DE SONORA

LICENCIATURA EN BIOLOGÍA

Práctica 4: Aislamiento de cloroplastos de células vegetales

Núñez S Palomares Fernanda

Hermosillo, Son. A 20 de Junio de 2014

Introducción

Los cloroplastos son organelos citoplasmáticos exclusivos de las células vegetales, varían en forma, tamaño y número de unas células a otras. Son pequeños y muy numerosos; en una célula se pueden encontrar hasta 10,000. Son visibles al microscopio óptico, aunque para observarlos a detalle es necesario el microscopio electrónico.

En las células de las algas suele haber uno o dos muy grandes y de diversas formas: esféricos, estrellados, acintados, etcétera; en cambio, en las plantas superiores pueden contarse hasta cuarenta o más por célula, y su forma predominante es esférica u ovalada.

Poseen una estructura tan complicada como la de la mitocondria. Un cloroplasto presenta dos membranas: una externa que lo delimita y otra interna que se repliega hacia el interior, en donde existe un tercer conjunto de membranas que forman cavidades aplanadas llamadas tilacoides.

Los cloroplastos  presentan una coloración verde porque en su interior producen un pigmento verde denominado clorofila, una sustancia química, con una propiedad que la hace imprescindible para la vida: es capaz de captar la energía solar y hacer que ciertas moléculas inorgánicas se conviertan en compuestos orgánicos. En definitiva, la clorofila permite que sustancias inorgánicas, que tienen energía se transformen en compuestos orgánicos ricos en energía.

Las moléculas de clorofila, junto con otros pigmentos y proteínas, forman los fotosistemas; éstos se hallan incluidos en las membranas tilacoidales y facilitan un mejor aprovechamiento de la energía de la luz.

Los tilacoides se agrupan en unas pilas denominadas granas; de este modo muchas moléculas de clorofila pueden empaquetarse en un espacio pequeño, algo muy importante para la función que desempeñan.

La cavidad interna del cloroplasto que rodea a los tilacoides se denomina estroma; en donde también se encuentra el ADN y los ribosomas.

La función de los cloroplastos es realizar la fotosíntesis, proceso por el cual los seres vivos con clorofila son capaces de formar materia orgánica a partir de agua, CO2 y/o sales minerales gracias a la energía luminosa. En otras partes de la planta donde la luz no llega, como la raíz, las células no poseen cloroplastos.

Sin embargo, estas células acumulan granos de almidón en organelos parecidos a los cloroplastos, que se denominan amiloplastos. Las papas, por ejemplo, contienen numerosos granos de almidón [1].

Resumen

En la presente práctica se aislaron cloroplastos de células vegetales con un propósito formativo, donde se hizo uso de una centrifuga para separarlos de los demás componentes celulares y así cumplir con el cometido. Primero se desvenó el tejido vegetal y se licuó junto con la solución de molienda. Después se pasó, con pipetas Pasteur, a seis tubos para centrifugación. Se pesaron los tubitos para que al momento de meterlos a la centrifuga, ésta no sufriera un desequilibrio en el rotor. Se colocaron los tubitos de tal forma que uno quedara enfrente del otro y se pasó a la centrifugación. Se hizo esto dos veces, la primera a 200 xg y la segunda a 1000 xg a baja temperatura, pesando y quitando el respectivo sobrenadante.

Una vez que ya se obtuvieron los cloroplastos, se colocó una gota de suspensión salina con unas gotas del pellet y se pasó a observación.

Objetivo

Aislar los cloroplastos de hojas de espinacas para su observación en un microscopio óptico.

Materiales

• Hojas de espinacas frescas
• Solución de molienda (0.33 M sorbitol, 10 mM pirofosfato de sodio Na4P2O7, 4 mM MgCl2, 2 mM ácido ascórbico, ajustar pH a 6.5 con HCl)
• Solución de suspensión (0.33 M sorbitol, 2 mM EDTA, 1 mM MgCl2, 50 mM HEPES, ajustar pH a 7.6 con NaOH) o en solución 0.035 M de NaCl (frío)
• Solución de HCl para modificar pH
• Solución de NaOH para modificar pH
• Hielera
• 1 varilla de cristal
• Tabla para cortar y cuchillo
• Papel aluminio
• Mortero y pistilo
• Papel filtro o estopilla
• 2 tubos de 50 mL para centrifugar
• 2 pipetas Pasteur
• Equipo de filtración
• Bomba
• Centrifuga preparativa refrigerada
• Balanza semianalítica
• Microscopio

Métodos

1. Preparar un baño de hielo y pre-enfriar todo el material de vidrio que se usará.

2. Seleccionar algunas hojas de espinaca frescas y remover las venas más grandes rasgando las hojas. Pesar 4 g de tejido de hojas desvenadas.

3. Cortar el tejido tan fino como sea posible usando tabla y cuchillo. Adicionar el tejido a un mortero que contenga 15 mL de solución de molienda y moler hasta obtener una pasta fina.

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