Practica de diseño de clonacion

Taller Bases moleculares de Terapia Génica[pic 1]

Práctica Diseño de vectores plasmídicos y virales

22 de marzo de 2019

Clonación del gen Tubb4 de Rattus norvegicus  en el vector retroviral pLXSN

Búsqueda de las secuencias nucleotídicas del vector de expresión, vector de clonación e inserto

1. Obtener la secuencia nucleotídica del vector de expresión pLXSN de la casa comercial Clontech/Takara

Opción 1. Ingresar a la página https://www.takarabio.com/search-results?term=631509 de la casa comercial Clontech/Takara, en el cuadro de búsqueda ingresar el término pLXSN.  Bajar el manual del vector de expresión, ir al mapa del vector y analizar el sitio múltiple de clonación. Elegir el par de enzimas de restricción que podrían utilizarse para la clonación del gen.  Obtener la secuencia nucleotídica del vector en formato Fasta.

Opción 2. Ingresar a la dirección https://www.addgene.org/, que es un base de datos comercial de vectores de clonación.

En el cuadro de búsqueda, ingresar el término pLXSN.

A partir del resultado desplegado, seleccionar la liga para ingresar a la página del vector.  Dar clic al cuadro llamado Analyze sequence  que aparece en la parte inferior del mapa del vector.

Seleccionar la pestaña Sequence, elegir la opción Fasta y copiar la secuencia del vector en formato Fasta.  Pegar la secuencia en una hoja en Word/Office.

En el mapa del vector ubicar el MCS (posiciones 1470-1491 pb) para determinar las enzimas de restricción que se usarán para clonar el gen. Para el presente ejercicio se eligirán los sitios EcoRI y XhoI.

2. El siguiente paso  puede seguir dos rutas, la primera es obtener la secuencia del gen de interés  Tubb4 y analizar si es posible clonarlo en el vector pLXSN entre los sitios elegidos. Y la segunda, consiste en elegir un vector de clonación para amplificar el gen de interés y a partir de este realizar la subclonación al vector de expresión pLXSN.  En el presente ejercicio, seguiremos la ruta 2.  

B. Obtener la información del vector de clonación pUC18 requerido para la subclonación en el vector de expresión

Existen diversos vectores de clonación en todas las casas comerciales como Qiagen, Promega, Clontech,Takara, Sigma, Invitrogen, etc.  Elegimos usar al  vector pUC18 solo para clonar el producto de PCR y posteriormente subclonarlo en el vector pLXSN.  

Obtener la secuencia del vector y la información técnica para realizar la clonación.

Opción 1. Ir a la dirección https://www.takarabio.com/vector-database/  en el cuadro de búsqueda ingresar el término pUC18 (solo este, aparece otro término de búsqueda, usar solo pUC18). Elegir la primera liga de los resultados. Ir a la sección pUC18 de la página, elegir la pestaña Documentos y bajar la ficha técnica. Ir al mapa del vector y verificar la presencia de los sitios de restricción elegidos.  Es deseable que los sitios elegidos para el vector de expresión no estén presentes en el vector de clonación pues la estrategia para la subclonación será realizar la digestión del ADN recombinante pUC18-Tubb4 usando las enzimas elegidas.  En caso de estar presentes uno o ambos sitios de restricción, se sugiere usar otro vector aunque cabe aclarar que es factible usar el vector.

Opción 2. Ir a la dirección https://www.addgene.org/vector-database/  en el cuadro de búsqueda ingresar el término pUC18. Seguir la liga para obtener el mapa del vector  así como la secuencia nucleotídica.

Si se elige esta última opción, ir a la dirección  http://nc2.neb.com/NEBcutter2/   NEBcutter V2.0, ingresar la secuencia nucleotídica del vector en el cuadro central, abajo elegir la opción circular para la secuencia y dar clic en Submit.  Aparece el mapa del vector, en la parte inferior izquierda en el menú aparece la opción Custom Digest, dar clic y se despliegan todas las enzimas que podrían digerir al vector, es deseable que en la lista no aparezcan las enzimas seleccionadas para clonar en el vector de clonación. Al igual que en la instrucción anterior, en caso de estar presentes uno o ambos sitios de restricción, se sugiere usar otro vector aunque cabe aclarar que es factible usar el vector.

En caso de no usar el vector pUC18, se sugiere usar el vector de clonación  pGEM-T de la marca  comercial Promega cuya información completa se obtiene en la dirección https://worldwide.promega.com en el cuadro de búsqueda introducir el término pGEM-T, bajar el manual de clonación y en la página 2 del manual analizar el mapa del vector. La secuencia nucleótidica podrá obtenerse a partir de

1. Obtener la secuencia nucleotídica del gen de interés Tubb4 de Rattus norvegicus

Ingresar a la dirección https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/ , en el cuadro de búsqueda ingresar los términos de búsqueda: tubulin, beta 4A class IVa o el ID NM_080882.1, debe encontrarse la secuencia con la siguiente información:

Rattus norvegicus tubulin, beta 4A class IVa (Tubb4a), mRNA

NCBI Reference Sequence: NM_080882.1

2086 bp    mRNA    linear

Ir a la sección CDS de la página  para obtener la secuencia nucleotídica de la región codificante en formato Fasta.

Determinar si la secuencia nuleotídica del gen Tubb4 contiene sitios de restricción para las enzimas elegidas EcoRI y XhoI.  Para estar opción ir a la dirección: http://nc2.neb.com/NEBcutter2/ . En el cuadro central ingresar la secuencia del gen en forma lineal y dar clic en Submit.   En la parte inferior del mapa de restricción obtenido elegir la opción Custom Digest, verificar la existencia de los sitios EcoRI y XhoI. La presencia de  uno o ambos sitios de restricción, en caso de observar uno o ambos sitios en la secuencia a clonar será necesario elegir otro vector de expresión.

Diseño del vector de expresión pLXSN-Tubb4

En el presente ejercicio, se utilizarán los vectores pLXSN y pGEM-T.

1. Diseñar oligonucleótidos para clonar la secuencia del gen Tubb4 incorporando el sitio  de restricción EcoRI  en el oligo Forward y el sitio XhoI en el oligo Reverse.  Buscar los sitios de corte en cualquier herramienta Web.

Utilizar como base los oligonucleótidos diseñados en la semana 1 del presente taller, solo será necesario incorporar los sitios de restricción y optimizar los parámetros fisicoquímicos de los oligos para realizar la PCR de punto final.  Se sugiere usar el programa Perl Primer.

1. Verificar que la secuencia  del gen y su fusión con los sitios de restricción no modifican el marco de lectura. Para comprobar este punto es necesario realizar la traducción in silico del nuevo oligonucleótido en   la dirección http://www.expasy.ch/translate en el cuadro de búsqueda ingresar la secuencia nucleotídica de los oligos incluyendo el sitio de restricción y verificar que la traducción corresponde a la secuencia de la proteína en sus extremos N-terminal (oligo Forward) y C-terminal (oligo Reverse).  

Esta comparación requiere una rápida inspección de la secuencia aminoacídica de la proteína Tubb4.  Ingresar a la dirección https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein,  en el cuadro de búsqueda ingresar el nombre de la proteína de interés.  La información que debe obtenerse es la siguiente:

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