Previo 6. Amplificación de un fragmento de DNA por PCR

|                Previo 6. Amplificación de un fragmento de DNA por PCR

1. ¿En qué  proceso biológico se fundamenta la PCR?

La técnica se basa en la replicación de DNA en los organismos eucariotas realizada por la DNA polimerasa. Estás enzimas realizan la síntesis de una cadena . Para crear esta región se usan los primers , los primers son una pareja de oligonucleótidos sintetizada de manera que son complementaria a cada uno de los extremos 3’ del fragmento de DNA que se desea amplificar.

1. ¿ Cuales son los elementos que constituyen la reacción de PCR  y describe su función?

• DNA --- Molde
• Cebadores ---- Marcan inicio de replicación
• DNA  polimerasa --- Lleva a acabo la replicación del gen que se quiere amplificar.
• Desoxinibonucleotidos trifostados --- Sustratos para  polimerizar nuevo DNA
• Mg ----- Para mutagénesis
• Buffer ---Mantiene pH adecuado  

1. Explicar el uso de oligos sentido y antisentido

Delimitan la zona de ADN a amplificar, es decir, corresponden a los nucleótidos que definen los extremos de la secuencia que se desea replicar.

1. ¿Cómo influye la temperatura de alineamiento en la reacción de PCR?

Si la temperatura de alineamiento es muy baja, obtendremos un PCR menos específico, y si es muy alta, la especificidad será mayor ( aunque si es demasiado alta no se llevará a cabo la amplificación , pues la unión de los oligonucleótidos con sus sitios complementarios será poco estable y la polimerasa no podrá mediar la síntesis .

1. ¿Cómo se obtiene la temperatura de  alineamiento de los oligonucleótidos?

La temperatura y el tiempo requerido para el alineamiento de los primers depende de la composición, tamaño y concentración de los primers amplificadores.

Para las secuencias de 20 Pb  

Tm= 2°C (A+t) + 4°(G+C)

Donde se asume una concentración de sal de 0.9 M , y otros ensayos de hibridación.

1. ¿Cuál es la función de la formamida?

Estabiliza la estructura secundaria del DNA. Generalmente se recomienda utilizar del 11% hasta el 5%

1. Menciona variantes de la PCR

• Amplificación con inicio o arranque caliente
• Amplificación mediante activación progresiva de la polimerasa
• Amplificación con rampa descendiente de temperaturas
• Amplificación a partir de RNA (RT- PCR)
• Amplificaciones múltiples

Referencias .

Armendariz, J. 2013 “Biología molecular . Fundamentos y aplicaciones en las ciencias de la salud.” Ed. Mac Graw Hill, México.

Falcon, L.  Las herramientas moleculares , México http://www2.inecc.gob.mx/publicaciones/libros/530/cap16.pdf 28/02/16

Laboratorio de Genómica.  Genómica. Facultad de Medicina UASLP, México.  http://www.genomica.uaslp.mx/Protocolos/Extraccion%20DNA%20PCI-CC.pdf   13/03/2016

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