Producción reuterina

Metodología.

Reactivación de la cepa.

La reactivación de la cepa L. reuteri ATCC 53608 (Vial R-4) se realiza según el instructivo

Documentos: Formato solicitud de cepas.

Inóculo

Materiales:

Cepa en caja reactivada, 20 mL de caldo MRS, incubadora a 37 °C, asas estériles, cabina, descartador.

Procedimiento

Tomar algunas colonias de la caja e inocularlas a un caldo de 20 mL e incubar a 37 °C, 100 rpm por 18-24 h

Documentos: Formato solicitud de material, formato preparación de medios de cultivo.

Producción de biomasa

Materiales

4 caldos MRS de 50 mL, 10 puntas de 1 mL, 15 puntas de 10 mL, inóculo, frasco de desechos, 15 tubos falcon de 50 mL (centrifugar), 500 mL agua bufferada  (AB) o sln salina, micropipetas de 10 y 1 mL, 10 tubos falcon de 50 mL (guardar sobrenadante), centrifuga.

Procedimiento.

Adicionar 2 mL de inóculo a cada uno de los tres caldos MRS e incubar a 37 °C y 100 rpm por 18-24 h. Incubar también el caldo MRS sin inocular (control negativo).

Pasado el tiempo de incubación, adicionar 40 mL del medio fermentado  en un tubo falcon de 50 mL. Centrifugar a 4000 rpm por 15 min. Adicionar el sobrenadante en tubos falcon y guardar. Resuspender el pellet con ~20 mL de AB. Centrifugar a 4000 rpm por 15 min. Descartar sobrenadante. Resuspender nuevamente. Centrifugar. Descartar sobrenadante. Resuspender en 12 mL de AB. Utilizar 4 mL para cuantificar biomasa y el restante para producir reuterina. Realizar el mismo procedimiento para el control negativo.

Producción de reuterina.

Materiales: Suspensión de L. reuteri, 100 mL de solución estéril de glicerol (200 mM), 10 tubos de ensayo, 5 sobres de anaerobiosis, incubadora, puntas de 10 y 1 mL, micropipetas, caja de anaerobiosis.

Procedimiento

Solución de glicerol 200 mM: Pesar 18.4 g de glicerol puro por cada L de  solución.

Mezclar 5 mL de la suspensión de L. reuteri con 5 mL de la solución de glicerol (200 mM) en un tubo de ensayo. Incubar por 2 h a 37 °C en anaerobiosis. Centrifugar por 15 min a 4000 rpm  y guardar sobrenadante para cuantificar reuterina.

Realizar el mismo procedimiento con el pellet del MRS sin inocular.

Cuantificación de Biomasa.

Materiales: Suspensión de L. reuteri, cajas de Petri pequeñas (pre-secadas al horno y pesadas), puntas de 10 mL, AB, micropipeta de 10  mL, horno, descartador.

Procedimiento.

Adicionar 3 mL  de la suspensión en una caja de Petri. Secar a 110 °C por 4 horas.

Pesar y calcular la biomasa seca por medio de la diferencia de pesos.  

Cuantificación de reuterina.

Realizar previamente la curva de calibración.

Materiales: Sobrenadante con reuterina, solución de acroleína [¿] (control positivo), control negativo, micropipetas, puntas de 1 mL y 10 mL, HCl fumante, solución 0.01 M de Triptófano, baño de María a 37 °C, espectrofotómetro, celdas desechables, agua purificada, guantes de butilo.

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