Se demostró que el método SLICE y la mutagénesis dirigida al sitio basada en PCR mediada por SLiCE

1. Referencia bibliográfica (Motohashi, 2015)

Motohashi, K. (2015). A simple and efficient seamless DNA cloning method using SLiCE from Escherichia coli laboratory strains and its application to SLiP site-directed mutagenesis. BMC Biotechnology, 15, 47. doi:10.1186/s12896-015-0162-8

1. Objetivo:

Se demostró que el método SLICE y la mutagénesis dirigida al sitio basada en PCR mediada por SLiCE  (mutagénesis dirigida al sitio SLiP) podría llevarse a cabo utilizando extractos de una cepa habitual de laboratorio de E. coli.

1. Resumen

Se utilizaron 6 tipos de cepas de E. coli, DHB10B, JM109, DH5a, XL10-Gold, mach1 t1 y SURE2, también se usó ECOS X Competent E. Coli DH5alfa, debido a que son células químicamente competentes para la transformación de ADN recombinante en el método de SLiCE con el fin de determinar la eficacia de la transformación. Para la preparación del extracto de E. coli, se precultivaron las cepas en LB Miller y se trasfirieron a un medio 2x YT en un matraz de agitación Sakaguchi; se las cultivó a 37º C hasta que alcanzó un valir de 2,0-3,0 de OD600 (la fase logarítmica tardia). El tiempo de incubación fue de 3.5 a 6.5 horas y se recuperaron las células por centrifugación para ser lavadas en agua fría esteril, procediendo a otra centrifugación con las que se obtuvo de 0,25-0.40 g de células húmedas recuperadas, después se resuspendieron en un buffer de lisis celular de E. coli, CelLytic B; dichos lisados se centrifugaron. Luego se desechó el sobrenadante y se agregó glicerol frío al 80%. Este extracto SLiCE se alicuotó y se congeló en nitrógeno líquido para almacenar a -80º C.

Para la transforación se utilizó genes de peroxirredoxina II de Arabidopsis y el cloroplasto desidrogenasa de gluc-6-fosfato, se usó el ADN pET23a y pET23d, el segundo para analizar la eficacia por linealizacion con enzimas de restricción. La solución de SLiCE posee el vector lineal, ADN de inserto, buffer SliCE, extracto de SLiCE y agua destilada esteril. De esta manera se obtiene las células E.Coli transformadas que fueron sembradas en placas de gar LB con ampicilina y se incubaron a 37ºc por 12-16h. Luego se analizó la eficacia de las reacciones de SLICE, numero de colonias por nanogramo de vector, proporción de colonias con una inserción de longitud correcta mediante PCR, se observó la precisión de clonación con PCR, y el inserto en los sitios de clonación se determinó por secuenciación de ADN. Para la mutagenesis dirigida al sitio mediante una PCR mediada por SLICE (SLIP), SE UTILIZARON primers específicos diseñados en  el programa PrimerX con una temperatura de fusión >78ºC y la terminación con Guanina o citidina para el kit  de mutagenesis dirigida al sitio QuickChange.

Este estudio se realizó en el Departamento de Biorecursos y Ciencias del Ambiente, Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad de Kyoto Sangyo, Japón 

1. Resultados

Se sabe que la cepa de E. coli PPY aumenta la formación de colonias durante el fragmento de clonación en PCR, pero en este estudió se utilizaron diferentes cepas con modificaciones, donde se comprobó que la clonación de fragmento de PCR de una región de 19 pb de solapadas en los vectores se asociaron con una alta formación de colonias, a su vez se analizó un no extracto que contenia solo ADN y el vector el cual también pudo clonar en PCR, pero las eficacias de transformación fueron menos efectivas para el método de SLICE de diferentes cepas, a pesar de esto se pone en revelación la especificidad del nuevo método, la preparación SLICE podría dar una eficacia de 2-10x103 colonias /vector, lo que indica que también se pueden utilizar diferentes cepas a PPY de E coli para SLICE. Mediante una secuenciación de ADN se analizo,la longitud minima de solapamiento, dando 15 pb para la correcta inserción de fragmentos de ADN en el vector, pero se encontró que 10 pb fueron suficiente para la inserción a pesar de que la eficiencia y fidelidad se redujeron; y los fragmento de PCR con un solapamineto de 19 pb produjeron el numero máximo de colonias luego de la transformación. Para el analis de SLICE para ensamblar ADN en vectores con secuencias flaqueantes heterologas, se digirió los vectores pET23 con enzimas de restricción, los insertos podrían incorporarse en vectores pero la eficiencia varió de acuerdo con la combinación precisa de enzimas de restricción utilizadas, esto puede reduir notablemente la eficacia de clonación mientras que La fidelidad de clones de colonias de PCR positivos fue mínimamente afectada por las secuencias flaqueantes. Las condiciones para la reacción SLiCE se optimizaron para los extractos de E. coli JM109. los períodos de incubación entre 5 y 60 min, aumentaron el numero de colonias por vector y la saturación de reacción alcanzó rápidamente, pero esto podía degradar los insertos de ADN y de vectores por esto se determinó la reliacion molar de inserto: vector de 1:1 a 3:1 para ser altamente eficiente y formanodo 2x103 ng colonias/vectores, de igual manera se logró la reducción de pasos en el proceso de purificación siendo la clonación eficiente entre 5 a 7 veces mediante la precipitación con etanol o ExoSAP-IT, las columnas de purificación de PCR aumentaron de 37 a 138 veces. La nueva técnica mediada por SLICE en PCR dirigida al sitio mutagénesis (SLIP mutagénesis dirigida al sitio) simplifica el método de extensión por solapamiento original, mediante la eliminación de varios pasos. Aunque la mutagénesis dirigida al sitio QuickChange también minimiza el número de pasos, SLIP mutagénesis dirigida al sitio tiene la ventaja añadida de que sólo la región de inserción (y no todo el plásmido) se amplifica por PCR.

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