DETERMINACIÓN DE VIBRIO CHOLERAE

DETERMINACIÓN DE VIBRIO CHOLERAE

Fundamento del método.

El Vibro choleraepertenece a la familia Vibrionaceae, género Vibrio. Es un bacilo pequeño, curvo, móvil mediante un flagelo polar único, no encapsulado, no esporulado, Gram negativo, aerobio y anaerobio facultativo, oxidasa positivo.

El Vibro cholerae01 es agente causal del cólera, enfermedad diarreica producida por una toxina segregada por el microorganismo en el intestino, suele presentarse en comunidades donde las prácticas de higiene son muy deficientes.

 EI Vibrio cholerae 01 se divide en 2 biotipos El Clásico y El Tor, y puede pertenecer a los serotipos Ogawa, lnaba e Hikojima.

Equipo y Material

• Incubadora a 35 0C +/-2 0C
• Refrigerador a 0 -50C
• Cajas de petri estériles
• Pipetas de 1 mL estériles
• Frascos estériles con capacidad de 500 mL
• Cabina de flujo laminar
• Pipeteador
• Microscopio
• Asa de inoculación
• Gradillas
• Bolsas de plástico estériles
• Homogenizador o aparato similar
• Balanza de capacidad no inferior a 2.500 g sensibilidad 0.1 g
• Instrumentos para preparar las muestras
• Cuchillos, tenedores, Pinzas, tijeras, cucharas, espátulas, morteros con sus respectivos pistilos estériles.
• Laminas portaobjetos
• Tubos tapa rosca estériles

Medios de cultivo y reactivos

• Agua de peptona alcalina
• Agar tiosulfato citrato sales biliares sacarosa. T.C.B.S.
• Agar nutritivo con NaCI al 1%
• Agar Infusión cerebro corazón (BHI)
• Caldo de peptona azúcar 1%: glucosa, sacarosa, arabinosa. manosa, manitol, e inositol.
• Caldo L- lisina 1%, L- arginina 1%, L- ornitina 1%.
• Agar hierro triple azúcar (TSI).
• Agar Kliger.
• Caldo nitrato.
• Reactivo de Griess.
• Polvo de zinc.
• Desoxicolato sódico 0.5%.
• Reactivo para Oxidasa.
• Reactivos para coloración de Gram
• Antisueros (Polivalente, Inaba, Ogawa)

Preparación de la muestra para el análisis

• Pescado entero: remover la carne alrededor de las tripas, agallas y piel, para conformar la unidad de muestra necesaria para el análisis.
• Moluscos:        preparar una muestra de 10  a 12 animales o 20 a 30 animales pequeños que incluya el licor de conchas, para conformar la unidad de muestra necesaria para el análisis.
• Crustáceos: extraer la carne para conformar la unidad de muestra.
• Frutas y  vegetales: enjuagar cada fruta o vegetal con el agua peptonada alcalina

    (225 mL) en una bolsa plástica estéril.

• Frutas pequeñas: utilizar 5 unidades (ejemplo: 5 tomates).
• Frutas grandes: utilizar una unidad (ejemplo: melón, sandía).
• Vegetales con hojas: tomar mínimo 5 hojas externas completas.

Procedimiento

1.        Pesar 25 g del total de la muestra en un erlenmeyer o frasco que contenga 225 mL de agua de peptona alcalina y mezclar cuidadosamente. Figura 11.

2.        lncubar a 35 0C +/-2 0C,por 6 horas.

3.        Pasado el tiempo de incubación, sin mezclar el frasco o erlenmeyer, realizar un barrido de la superficie del cultivo con el asa y sembrar en superficie por agotamiento en Agar tiosulfato citrato sales biliares sacarosa  (T.C.B.S.).

4.        Incubar a 35 0C +/-2 0C  por 18-24 horas.

5.        Pasado este tiempo observar las colonias tipicas de V. choieraeen el Agar TCBS las cuales son grandes, (2-3 mm) lisas, amarillas y ligeramente aplanadas, con el centro opaco y la periferia translúcida.

6.        Tomar un mínimo de 3 colonias y sembrar en Agar nutritivo o en Agar BHI por estría e incubar a 35 0C +/-2 0C por 18-24 horas.

7.        Pasado este tiempo realizar la prueba de la oxidasa y de la cuerda de la siguiente manera:

Prueba de la Oxidasa

En una caja de petri, colocar papel de filtro e impregnarlo con el reactivo para oxidasa. Hacer un extendido con asa de vidrio o palillo de madera de una colonia sospechosa, sobre el papel de filtro impregnado con el reactivo, siguiendo una línea de 3 a 6 mm de longitud.

Reacción positiva: azul violeta

Reacción negativa: No hay cambio de color

Hacer controles positivo y negativo con cepas conocidas.

Prueba de la cuerda

Elegir una colonia del Agar nutritivo o Agar BHI, emulsificarla sobre un lámina portaobjeto, con ayuda de un asa, en una gota de suspensión acuosa al 0.5% de desoxícolato sódico. En 60 segundos se forma una masa mucoide, que al ser elevada del portaobjeto, por medio del asa, forma hilos.

Si la prueba de la oxidasa y de la cuerda son positivas; a partir de las colonias de Agar nutritivo o Agar BHI realizar las pruebas bioquímicas

Identificación de Vibrio choleraemediante pruebas bioquímicas

Fermentación de carbohidratos

Inocular con asa los tubos con caldo carbohidrato azúcar 1%: glucosa, sacarosa, arabinosa, manosa, manitol e inositol. Incubar a 35 0C +/-2 0C por 24 -48 horas.

Si se produce un cambio de color, según indicador de pH utilizado, la reacción es positiva.

Prueba de la decarboxilación de aminoácidos

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