Protocolos extracción ADN y ARN

Extracción de DNA

Buffer de extracción: Se utiliza para liberar el DNA del interior de las células. Estos buffer contienen detergentes, como el sodio dodecilo sulfato (SDS) o Triton X; un compuesto quelante (EDTA) que se une a cualquier complejo metálico en solución cuando se encuentra de-protonada, quitando los cationes de la solución que pueden desestabilizar la membrana celular e inhibir las ADNasas; sales que cubran el DNA formando una capa iónica suave protegiéndolo y evitando su degradación; Tris-HCl que mantiene el pH de la solución estable entre 7.5 y 8.2, y proteinasa K para degradar proteínas o enzimas (Falcón & Valera, (S.f)).

Acetato de potasio: Se utiliza para retirar las proteínas denaturadas y la mayoría de polisacáridos de la meustra producto de la reacción con el buffer de extracción y la posterior incubación a 65°C (Velasco, 2005).

Isopropanol: Para separar el DNA de la fase acuosa y es selectivo en la precipitación de DNA cuando hay RNA en la muestra (Velasco). Disminuye la solubilidad del DNA para que pueda precipitar de la solución. Dado que el DNA es iónico es altamente soluble en agua pero no soluble en disolventes orgánicos (FarmUpibi, 2011).

Buffer TE: Resuspender y eliminar sobrenadante mientras el DNA es protegido de la degradación (Falcón & Valera). Sirve como amortiguador dado que es inocua para la mayor parte de las proteínas además de evitar la acción de las nucleasas (FarmUpibi).

Fenol: Para eliminar las proteínas (como nucleasas) (Falcón & Valera).

Cloroformo: Para eliminar contaminantes lipídicos. Generalmente, después de la precipitación con fenol, se hace con cloroformo para limpiar la muestra (Falcón & Valera).

Alcohol isoamílico: Para limpiar trazas de fenol y evitar la espuma.

Acetato de sodio: Es una sal que permite que el DNA cargado negativamente adquiera una capa iónica positiva que permita que se precipite (Falcón & Valera). Permite concentrar el DNA después que se han eliminado las proteínas (Zabala, 2005).

Etanol: Precipitación del DNA. Remueve la concentración residual de sales y promueve la precipitación (Falcón & Valera). Además, permite eliminar los residuos de fenol y cloroformo (Puerta & Ureña, (S.f)).

Extracción de RNA

Buffer de extracción: Al igual que en la extracción de DNA, el buffer de extracción tiene la función de realizar la lisis del tejido y solubilizar membranas lipoproteicas y la desnaturalización de las proteínas. Simultáneamente, el RNA es protegido por enzimas degradativas1.

Fenol: Utilizado tanto para eliminar las proteínas como para separar el RNA del DNA en la muestra, permitiendo que a pH ácido el RNA más hidrofílico que el DNA permanece en la fase acuosa de la muestra mientras que el DN queda en la interfase2.  

Cloroformo: Para eliminar contaminantes lipídicos. Generalmente, después de la precipitación con fenol, se hace con cloroformo para limpiar la muestra (Falcón & Valera).

Agua DEPC: Contiene dietil dicarbonato que es usado para inactivar RNAsas (Gómez & Royo, 2008).

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