Aislamiento Leucocitos

Al estratificar una muestra de sangre sobre el ficoll-diatrizoato y centrifugar, las

células mononucleares se separan de las demás debido a diferencias de densidad. Como se mencionó, el ficoll aglutina los eritrocitos, por lo que estos pasan a través del medio y sedimentan al fondo. Los granulocitos también sedimentan por su tamaño y densidad, y

por su tendencia a formar agregados. Los mononucleares (linfocitos y monocitos), por su

menor densidad, se quedan en la interfase entre el plasma y el medio (Figs.1.1 y 1.2), con

una contaminación relativamente baja de plaquetas y otros tipos celulares. Al final de la

centrifugación, los leucocitos mononucleares se recogen del anillo blanco que se forma en

la interfase entre el plasma y el ficoll-diatrizoato. E

Este aislamiento se puede realizar por varios métodos

pero en esta ocasión vamos a hacer referencia a la “Separación por gradiente de

densidad”, utilizaremos la centrifugación sobre una solución de densidad definida

como es el Ficoll-Hypaque. El Ficoll es un polímero de carbohidrato y metrizamida

(compuesto denso que contiene yodo) y que permite que se hundan los eritrocitos

y los granulocitos (debido a su mayor densidad = 1.077), y que floten las células

mononucleares (linfocitos y monocitos); por ello, que tras la centrifugación nos

será fácil obtener las células mononucleares de sangre periférica.

Este aislamiento se puede realizar por varios métodos pero en esta ocasión vamos a hacer referencia a la “Separación por gradiente de densidad”, utilizaremos la centrifugación sobre una solución de densidad definida como es el Ficoll-Hypaque (Lymphoprep). El Ficoll es un polímero de carbohidrato y metrizamida (compuesto denso que contiene yodo) y que permite que se hundan los eritrocitos y los granulocitos (debido a su mayor densidad = 1.077), y que floten las células mononucleares (linfocitos y monocitos); por ello, que tras la centrifugación nos será fácil obtener las células mononucleares de sangre periférica para nuestro estudio

Cargar 8 mL de sangre diluida con suero fisiológico en pipeta milimetrada y dispensar muy cuidadosamente y lentamente sobre el Ficoll-Hypaque en el tubo de centrifuga. Poner el tubo inclinado y apoyar la punta de la pipeta sobre la pared del tubo para dejar deslizar la sangre suavemente sobre el Ficoll y poder formar una interfase (Ficoll abajo y sangre arriba).

Extraer toda la banda de células mononucleares utilizando pipetas pasteur de plástico y dispensar en

Después se ubicaron lentamente sobre el gradiente de densidad Ficoll-Ipaque Plus (Amersham, São Paulo, Brasil) para separación de las células en la densidad 1,077g/mL y proporción de 2:1 (médula ósea: gradiente) (15). Luego de la centrifugación a 495 g por 30 min a 15 ºC, se removió el sobrenadante y el anillo celular formado sobre la solución de Ficoll fue cuidadosamente colectado mediante una pipeta

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