Microbiologia-metodos Inmunologicos

Introducción

La utilización cada vez más generalizada de las técnicas inmunológicas en el análisis de los alimentos para detectar la presencia de microorganismos, toxinas u otros metabolitos microbianos, es consecuencia del éxito previo que alcanzaron en el campo del diagnóstico clínico.

Las técnicas inmunológicas son procedimientos analíticos basados en la visualización objetiva de la interacción entre un antígeno y su correspondiente anticuerpo, y debido a su sensibilidad, especificidad, rapidez y bajo costo, son especialmente útiles en el análisis microbiológico de los alimentos.

En el desarrollo de un ensayo inmunológico se identifican tres etapas fundamentales:

a. Preparación del antígeno

b. Obtención y evaluación del anticuerpo

c. Desarrollo de un inmunoensayo apropiado.

En la detección inmunológica de microorganismos, como antígenos para la inmunización de los animales se pueden utilizar células viables, células inactivadas por el calor u otros procedimientos, células sonicadas, proteínas purificadas de la pared celular o del flagelo en microorganismos móviles, lipopolisacáridos, ADN, etc., (26, 27). Una vez seleccionado el antígeno, la obtención de anticuerpos requiere el empleo de animales de experimentación. Cuando un antígeno se inocula en un animal (conejo, oveja, cabra, etc.), éste responde con la producción de una mezcla heterogénea de anticuerpos frente a distintos epítopos del antígeno y por ello reciben la denominación de anticuerpos policlonales.

La obtención de anticuerpos policlonales es sencilla, sin embargo su empleo conlleva una serie de limitaciones entre las que se pueden citar: 1) la obtención de inmunosueros en animales de experimentación es un proceso caro (dependiendo de la especie elegida) y éstos se sacrifican al final de la fase de inmunización, por lo que para obtener más inmunosuero habrá que inmunizar nuevos lotes de animales; 2) cada animal presenta una respuesta inmunológica diferente; 3) algunas técnicas de purificación de anticuerpos como la cromatografía de afinidad, aunque eficaces, son tediosas de realizar y 4) los anticuerpos policlonales específicos purificados constituyen una mezcla de inmunoglobulinas que pueden variar en su afinidad por los distintos epítopos del antígeno.

Un antígeno es una molécula de superficie celular, que puede inducir la formación de anticuerpos.

Los anticuerpos son moléculas proteicas secretadas por un tipo celular del sistema inmune, los anticuerpos tienen una altísima afinidad por sus antígenos correspondientes técnicas inmunológicas en el análisis microbiológico de los alimentos se ha visto favorecido por el desarrollo de la tecnología de obtención de anticuerpos monoclonales que permite disponer de clones de células híbridas o hibridomas que producen, de forma continua e ilimitada, anticuerpos específicos de actividad biológica conocida y especificidad constante.De todas las técnicas inmunológicas desarrolladas (aglutinación, inmunodifusión, inmunoelectroforesis, radioinmunoensayo, inmunofluorescencia, etc.,) la técnica inmunoenzimática de ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) constituye en la actualidad la más ampliamente utilizada en el análisis microbiológico de los alimentos. Se caracteriza por el empleo de marcadores enzimáticos para la detección y amplificación de las reacciones antígeno-anticuerpo.

METODOS INMUNOLOGICOS ENZIMATICOS UTILIZADOS EN EL ANALISIS MICROBIOLOGICO DE LOS ALIMENTOS

METODOS IMUNOLOGICO

Los métodos inmunológicos se basan en la especificidad de la unión Ag.- Ac.

En base a esta unión podemos dosar y caracterizar toda sustancia que pueda generar anticuerpos específicos contra ella.

Antígenos (Ag)

Se denomina antígeno (Ag.) a toda sustancia que, introducida en un organismo competente, provoque una respuesta inmunitaria, estimulando la producción de anticuerpos o de células sensibilizadas.

Se trata en general de moléculas complejas con grupos determinados, los cuales constituyen zonas restringidas que determinan la especificidad, estas zonas se denominan determinantes antigénicos o epitopes.

Dado que en una molécula antigénica existen varios epitopes diferentes, de ahí que se diga que un Ag. es polivalente , la inoculación de ésta originará en el receptor anticuerpos con distinta especificidad, cada uno de los cuales provendrá de un clon celular distinto ( respuesta policlonal)

El número de determinantes antigénicos constituye la valencia del Ag.

Esta puede ser:

valencia total = nº total de epitopes

valencia funcional = nº de epitopes expuestos, es decir disponibles para ser captados por el sistema inmune del huesped.

Los Ag. tienen 2 características básicas:

1º Inmunogenicidad: capacidad de generar Ac.

2º Especificidad : capacidad de unirse a ellos.

Existen moléculas que no son inmunogénicas por sí mismas pero sí son capaces de unir específicamente Ac, estas moléculas se denominan Haptenos ( ej. para aminobenceno, dinitro fluor benceno y Ac. sulfanílico).

Características de las que depende la antigenicidad:

-PM: debe ser mayor de 10KD, sin embargo hay moléculas como la de la insulina

( PM:6KD) y el glucagon (PM: 3.8KD) que pueden generar RI si son inoculadas con un adjuvante.

Otras sustancias de bajo PM como es el caso de los haptenos en cambio, deben inyectarse acopladas a una molécula inmunogénica llamada carrier para transformarse así en antigénicas.

-Inmunogenicidad de especie: por ej. los polisacáridos neumococcicos son buenos inmunógenos para el hombre pero no para el conejo.

-Relación propio-no propio: para ser inmunógeno, un Ag. no debe pertenecer a la especie animal de la cual se pretende obtener la respuesta inmune hacia él.

-Grupos químicos: - los radicales ácidos o básicos fuertes en las proteínas las hace mas inmunogénicas (principalmente los ácidos).

- la presencia de aminoácidos como tirosina o fenilalanina, ( la gelatina no los posee y por ello solo es antigénica cuando se inyecta con adyuvante).

-Rigidez de la molécula: las largas cadenas de las moléculas de los hidratos de carbono son fácilmente distorsionables y por lo tanto no generan una buena respuesta inmune. La alta especificidad de los grupos aromáticos en los aminoácidos de síntesis es debida a la rigidez del benceno. A su vez la posición de estos grupos también es significativa para la especificidad dado que los derivados D o L pueden diferenciarse serológicamente.

...