ASPECTOS DE LA REGULACIÓN DEL METABOLISMO DEL GLUCÓGENO

Maffrand, Leticia                   Comisión 06                          10/05/2015

MÓDULO III

ASPECTOS DE LA REGULACIÓN DEL METABOLISMO DEL GLUCÓGENO

PARTE A

Objetivo:

Demostrar la variación del glucógeno hepático en ratas sometidas a distintas condiciones experimentales.

Se usarán hígados obtenidos de ratas normales sometidas a las siguientes condiciones:

• Alimentadas normalmente
• Sometidas a ayuno

Materiales y métodos:

Según Guía de Trabajos Prácticos 2018. Cátedra de Química Biológica Superior. Facultad de Farmacia y Bioquímica – UBA.

Hígado de rata normal o ayunada

[pic 1]

Lavar con SF a 4º C, secar y pesar

[pic 2]

Cortar el hígado y triturarlo con arena lavada y KOH 30%

Mantener en frío

HOMOGENIZAR

[pic 3]

Incubar 20 min a 100º C y pasar a tubo centrifuga, luego enfriar en hielo

[pic 4]

Centrifugar 10 min a 3000 x g

[pic 5][pic 6]

                                   Sobrenadante                         Pellet (Descartar)

[pic 7]

Precipitar el Glucógeno con etanol               Centrifugar 10 min a 5000 x g[pic 8]

[pic 9][pic 10]

                                                            Pellet                        Sobrenadante[pic 11]

                                                                                               (Descartar)

                        Resuspender en H2Od

         (10 ml/g de hígado para ratas normales y 0,3ml/g para ratas sometidas a ayuno)

[pic 12]

                                    Agregar 0,6ml de HCl 2M / 0,4ml sc y calentar 30 min a 100º C

[pic 13]

Reacción de

Somogyi-Nelson                                  Neutralizar con 1 ml NaOH 1,2 M[pic 14]

Por qué usamos KOH?

Por qué usamos HCl?

Resultados

• Tabla 1: Curva de calibración (Espectrofotómetro Nº2)

• Gráfico 1: Curva de calibración

[pic 15]

• Tabla 2: Absorbancia de la muestra según las condiciones de la rata N6*

*Los µmoles de glucosa no pudieron ser calculados ya que están fuera de la linealidad de la curva de calibración del espectrofotómetro. No, tu blanco lo tomas como cero, con lo cual los valores del tubo 6 y 7 entran dentro de la curva igual. Tendrías que haberlos usado en la ecuación de la curva para ver cómo te daban los umoles de glucosa y ahí ver si descartabas o no .

• Tabla 3: Contenido promedio y desvío estándar de glucógeno % en hígados de las diferentes muestras y condiciones.

• Gráfico 2: Comparación de promedios y sus respectivos SD para las condiciones N6, N5 y A4

[pic 16]

PARTE B

Objetivo:

Determinar la actividad in situ de la glucógeno fosforilasa (GP) utilizando electroforesis en geles no desnaturalizantes (PAGE nativo). Comprar el efecto de moduladores sobre la GP hepática y muscular.

Materiales y métodos:

Según Guía de Trabajos Prácticos 2018. Cátedra de Química Biológica Superior. Facultad de Farmacia y Bioquímica – UBA.

Hígado de rata normal

[pic 17]

Lavar con SF a 4º C, secar y pesar

[pic 18]

Cortar el hígado y triturarlo con arena lavada y buffer de homogeneización

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