Adn Y Plasmidos Tp

Introducción

El presente trabajo práctico, compuesto por dos partes ha sido confeccionado de tal manera que éstas presenten una unidad temática, siendo el aspecto procedimental dividido en dos, uno consecuente del otro.

Se desarrollará, primeramente, una extracción de ADN de un solución de bacterias E. coli para poder aislar éste de los otros componentes celulares de dichas bacterias. Partiendo de este ADN aislado, y en condiciones que se detallarán, se realizará una electroforesis en geles de agarosa, y se analizarán los resultados.

Conceptos previos:

Los plásmidos son moléculas circulares extracromosómicas de DNA doble cadena presentes en bacterias y en algunas células eucariotas. En las bacterias, se encuentran en forma superenrollada y su tamaño puede variar desde pocos miles de pares de bases (pb) hasta más de 100 kpb. Los plásmidos no son esenciales para la supervivencia de la bacteria pero pueden contener genes que les otorguen características adicionales, permitiéndoles sobrevivir o crecer en condiciones desfavorables o competir con otros microorganismos que se encuentran en el mismo nicho ecológico. Los plásmidos bacterianos tienen un origen de replicación y se duplican de modo autónomo al DNA cromosómico, aunque la replicación depende de factores del hospedador para llevarse a cabo.

La electroforesis es una técnica para la separación de  HYPERLINK "http://es.wikipedia.org/wiki/Mol%C3%A9cula" \o "Molécula" moléculas según la movilidad de estas en un campo eléctrico. La separación puede realizarse sobre la superficie hidratada de un soporte sólido (p. Ej., electroforesis en papel o en  HYPERLINK "http://es.wikipedia.org/wiki/Acetato_de_celulosa" acetato de celulosa), a través de una matriz porosa ( HYPERLINK "http://es.wikipedia.org/wiki/Electroforesis_en_gel" electroforesis en gel), o bien en disolución (electroforesis libre). Dependiendo de la técnica que se use, la separación obedece en distinta medida a la carga eléctrica de las moléculas y a su masa.

Otras características a tener en cuenta

Plásmidos

La incompatibilidad plasmídica es la competencia natural entre dos plásmidos o más para permanecer dentro de la célula. Esto ocurre debido a que ambos plásmidos no pueden coexistir en la misma célula porque comparten parte del mecanismo de replicación.

Principalmente, los plásmidos en biología celular son utilizados como vectores de clonado, ya que se les inserta una secuencia de DNA de la cual se quiere estudiar sus características principales. Una forma de realizar esto es amplificando dicha secuencia en las bacterias.

Los plásmidos también se usan como vectores de expresión, que tiene como objetivo principal controlar el proceso de expresión de los genes presentes en el inserto, a través de la transcripción y traducción.

El ”ORI” es el origen de replicación de alto número de copias. El objetivo principal es dar comienzo a la replicación del DNA de la bacteria. El polylinker es una secuencia determinada y específica del plásmido, la cual es reconocida por ciertas enzimas de restricción. Además hay ciertos promotores que codifican para la síntesis de una determinada enzima (como es el caso del lac z).

Electroforesis:

Si se usara agua en la corrida, esta no arrancaría, debido a la mala conductibilidad.En el caso que se altere el ph del buffer, modificaría la corrida por la interacción de protones con los grupos fosfato, tanto negativa como positivamente según sea el ph utilizado.

el xilene-cianol es un colorante que migra como si fuera una molécula de DNA doble cadena de 5 kpb

El azul de bromofenol migra como si fuera una molécula de DNA doble cadena de 500 kpb

El glicerol es viscoso y evita que difunda el DNA.

Materiales y métodos

Parte 1: El método que se utilizó se denomina lisis alcalina y la cepa bacteriana utilizada fue la DH5a – E.coli conteniendo el plásmido pBluescipt de alto número de copias. Se parte de un pellet de estas bacterias que fue previamente crecido en medio líquido rico en nutrientes.

Las soluciones a utilizar son:

1 - Tris-HCL 50 mM, EDTA 10 Mm ph 8

La primera es el buffer y la segunda es para inhibir las nucleasas (enzimas que degradan ácidos nucleicos)

2 - NAOH 200mM y SDS 1%

Lisis de membranas bacterianas, degradación parcial de RNA y desnaturalización de DNA.

3 – K+ AcO- 3M ph 4,8

Renaturalizacion de DNA plasmídico y separación del DNA genómico.

4 - Isopropanol

Precipitación del DNA-

5 – Etanol 70%

Disolución de sales que hayan precipitado con isopropanol.

6 – Agregado de RNasa (solo algunos grupos)

Degradación de RNA.

A estos métodos, se agrega la centrifugación, que, como se verá en el desarrollo se realizara varias veces.

Parte 2:

Se utilizará :

1 - Solución de agarosa gelificada.

Agarosa 0.8%

Bromuro de etidio 10 mg/ml

TAE 1X

2 – Buffer de siembra 3X

Xilene-cianol 0.1%

Azul de bromofenol 0.1%

Glicerol 15%

3 – Buffer de corrida ( TAE 50X)

Tris base 242 g

Ácido Acético glacial 57,1 ml

EDTA 0.5 M pH 8

100 ml H2O hasta 1 litro

Esquema general de la preparación de un gel para electroforesis.

Desarrollo

Preparación de DNA plasmídico

Para realizar el primer paso, se efectuó la siguiente operatoria:

Cada grupo recibió, en tubos eppendorf, el pellet correspondiente a 1.5 ml de un cultivo bacteriano en fase estacionaria de una cepa de E. coli conteniendo un plásmido de alto número de copias, resuspendido en 0.3 ml de la Solución 1.

Se agregó 0.3 ml de Solución 2 y mezcló inmediatamente por inversión. Se incubó a temperatura ambiente no más de 5 min. La suspensión bacteriana, turbia, se volvió transparente y viscosa.

Se agregó 0.3 ml de Solución 3 (en hielo) y mezcló inmediatamente por inversión. La solución paóo de transparente a turbia.

Se centrifugó 15 min a máxima velocidad.

Se transfirió el sobrenadante a otro eppendorf.

Se agregó isopropanol (a temperatura ambiente) hasta llenar el tubo (0.6 - 0.7 ml). Mezclado por inversión.

Se centrifugó 30 min a máxima velocidad.

Se ve sobrenadante. Se agregó 500 ul de etanol 70%, se mezcló suavemente por inversión

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