Anatomía patológica y citodiagnóstico Práctica 4. Inclusión, corte y tinción

Anatomía patológica y citodiagnóstico                                                        Andrea Miguel Piñairo

Práctica 4. Inclusión, corte y tinción

Introducción

        Para observar cortes histológicos en el microscopio, debemos primeramente incluir nuestro corte previamente realizado del riñón en parafina, después utilizar el microtomo para realizar cortes micrométricos y para finalizar, teñir la muestra.

        La parafinización de los cortes se realiza mediante un parafinero el cual se calienta y libera parafina líquida. Los cortes se realizaron con un microtomo de rotación en el cual su portabloques está en posición horizontal y la cuchilla en posición vertical para producir cortes de más o menos 15 micras. Para la tinción, tuvimos que calcular los diferentes porcentajes de los alcoholes, añadir cada líquido en su correspondiente teñidores y poder teñir con facilidad.

Objetivo

• Aprender a manejar el parafinero
• Manejar con precisión y correctamente el microtomo
• Desarrollar adecuadamente el protocolo de tinción de hematoxilina-eosina

Materiales utilizados

• Parafinero
• Casete con muestra riñón
• Microtomo
• Baño
• Placa fría
• Estufa
• Portaobjetos
• Pinzas
• Pipetas pasteur plástico
• Cubreobjetos
• Cubetas con preparaciones para la tinción
• Hematoxilina
• Eosina
• Guantes
• Ácido clorhídrico
• Etanol 96% y 99%
• Xilol
• Bluing
• DPX

Protocolo parafinero

1. Coger el respectivo casete con el fragmento de riñón.
2. Romper la tapa delantera del casete.
3. Poner el casete debajo del parafinero e ir pulsando para que vaya cayendo parafina líquida sobre el casete con la muestra hasta que no se llegase a ver.
4. Introducir encima del casete la parte previamente retirada y apretar.
5. Volver a poner parafina líquida sobre el casete.
6. Coger el casete y depositarlo encima de la placa fría hasta que quede la parafina completamente dura.

Protocolo microtomo

1. Comprobar que tiene todos los componentes (cuchilla, portabloques..)
2. Introducir el bloque de parafina en el microtomo.
3. Desbastar el bloque quitando el exceso de parafina..
4. Comprobar que el mecanismo de avance esté entre 10 y 15 micras.
5. Comprobar que tiene una angulación de 15º para no tener errores en nuestros cortes.
6. Una vez realizados los cortes y elegimos los mejores, los introducimos al baño de agua caliente (40-50ºC)
7. Para recoger nuestras muestras, introducimos en el baño el portaobjetos previamente parafinado de forma horizontal para capturar nuestros cortes con ayuda de las pinzas si la necesitamos.

Protocolo tinción

1. Desparafinado en la estufa durante 20 minutos a 60ºC
2. Mientras se desparafinar los portaobjetos, se realizan los teñidores para la tinción en este orden:

1. 2 de xilol → 3 min cada uno
2. 2 alcohol absoluto → 3 min cada uno
3. 2 alcohol 96% → 3 min cada uno
4. 1 alcohol 70% → 3 min
5. Lavar en agua → 3 min
6. Hematoxilina → 10 mins
7. Alcohol ácido → 3 min
8. Lavar en agua → 3 min
9. Bluing → 3 min
10. Lavar en agua → 3 min
11. Alcohol 70% → 3 min
12. Eosina → 5 mins
13. Alcohol 96% → 3 min
14. 2 alcohol absoluto → 3 min cada uno
15. 2 xilol → 3 min cada uno

1. Una vez terminada la tinción, montamos nuestras muestras con DPX que cogemos 1 gota con una pipeta pasteur y la ponemos encima de nuestra muestra para luego pegar el cubreobjetos y dejarlo secar.

Cálculos

Antes de rellenar los cestillos de las tinciones hay que preparar ciertos reactivos que se van a utilizar:

Preparar etanol 70%

= 250 ml  ; = 96% ;  = 70%[pic 1][pic 2][pic 3]

96 x = 70 x 250 ; = ; = 182,29 182 ml etanol[pic 4][pic 5][pic 6][pic 7][pic 8]

250 - 182,29 = 67,71 68 ml agua[pic 9]

Preparar el alcohol ácido:

• Alcohol ácido 0,3%
• Etanol 99% → 350 ml
• Agua destilada → 150 ml
• HCl concentrado → 1,5 ml
• Añadir en la cubeta sólamente 250 ml

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