Análisis del ciclo celular y de la apoptosis

PRÁCTICA 3. Citometría de flujo

Análisis del ciclo celular y de la apoptosis

Fundamento

La determinación de ploidía de ADN y ciclo celular por citometría de flujo, en células marcadas con un colorante fluorescente que se une estequiométricamente al ADN, es un método relativamente simple. Entre otras aplicaciones, puede aportar una valiosa información acerca del efecto que sobre las células de cáncer ejerce un determinado fármaco.

Las células, marcadas con un fluorocromo (en este caso Ioduro de propidio), que se une estequiométricamente a los ácidos nucleicos, emiten fluorescencia proporcional al contenido cromosómico global. De esta manera se produce un patrón característico que refleja las fases del ciclo celular dentro de la población de células en estudio (ver figura), y que se reflejará en el correspondiente histograma, representando variaciones del contenido de ADN frente al número de células analizadas.

Debido a la toxicidad del Ioduro de propidio, debemos utilizar guantes

Material

Células de leucemia promielocítica humana (HL60), cultivadas en presencia o ausencia de 2-metoxiestradiol (10 μM)

PBS (1% FBS + 10 mM HEPES).

Etanol 70% frío (guardado a -20º)

Solución de Ioduro de propidio 40 μg/mL y RNAsa 100 μg/mL

EDTA 50 mM

Procedimiento

Día 1.

1. Cada grupo de prácticas recibirá dos tubos Eppendorf con 100 μL de HL60 control y tratadas con 2-metoxiestradiol (conteniendo unas 200.000 células). Rotular los tubos con el número del grupo y la letra C (control) o T (tratamiento) además del número de la práctica y del grupo.

2. Añadir gota a gota con agitación continua 1 mL de etanol 70% frío (guardar a -20º). Este tratamiento permeabiliza las células. El proceso ha de realizarse despacio y con cuidado para evitar la formación de agregados celulares.

3. Cerrar los tubos e incubar 1h a -20 ºC

4. Centrifugar a 400 g, 5 min.

5. Retirar el etanol por decantación (tener cuidado de no tirar el botón de células) y lavar con 1mL de PBS frío (1% FBS + 10 mM HEPES).

6. Centrifugar y volver a lavar, repitiendo el paso 5.

7. Centrifugar y retirar el sobrenadante.

8. Resuspender en 200 μL de PBS con Ioduro de propidio 40 μg/mL y RNAasa 100 μg/mL.

9. Añadir 100 μL de EDTA (de un stock de 50 mM). Cerrar los tubos e incubar con agitación a 37 ºC durante 30 min.

Analizar en el citómetro de flujo siguiendo el protocolo correspondiente. Día 2.

10. Analizar los datos, determinando el porcentaje de células en cada subpoblación del ciclo celular, y discutiendo el efecto provocado sobre las células de leucemia por el tratamiento con 2-metoxiestradiol.

...