Biobalistica

Biobalística

Introducción.

El término biobalística proviene de la unión de “biología y balística”. Este método fue ideado y refinado en la década de 1980, por un grupo de investigadores de la Universidad de Cornell (E.U.) e introducido por Sanford, en 1987, por primera vez. Esta técnica, se basa en la utilización de microproyectiles recubiertos del DNA que se desea transferir, que son disparados sobre los tejidos vegetales a altas velocidades, atraviesan la pared y la membrana celular y llevan al interior de la célula los genes de interés para su posterior integración en el genoma vegetal (Sanford, 2000; Martínez et al. 2004; Vasil, 2007).

Este sistema de transformación requiere de un dispositivo mecánico que permita realizar el bombardeo de los tejidos vegetales. Para que los microproyectiles puedan atravesar las membranas celulares y llegar al núcleo de las células blanco, deben ser impulsados a velocidades supersónicas. Para ello, se desarrollaron tres sistemas: por explosión de pólvora seca, por variación de fuerza de aceleración, a través de descarga eléctrica o por liberación de gas comprimido a alta presión (aire, helio, CO2 o N2). Los microproyectiles empleados son partículas aproximadamente esféricas (microesferas), elaboradas de materiales densos, como el oro o tungsteno, de diámetro variados, que pueden ir desde los 0,4 μm hasta 4 μm. El casete de expresión debe ser adherido a los microproyectiles y, para esto, se han diseñado varias metodologías, entre las más utilizada es la que emplea cloruro de calcio y espermidina, para la precipitación del DNA sobre los micorproyectiles (Bhat & Srinivasan, 2002; Altpeter et al. 2005; Sanford, 2000; Rao et al. 2009).

En la actualidad, el mecanismo de disparo se basa en una pistola especial que lanza las partículas a más de 400m/s sobre el tejido de forma, que penetran sin destruir la membrana celular. Todo el sistema funciona en un vacío moderado para evitar el rozamiento con el aire, condiciones que las células vegetales soportan durante uno o dos minutos. Tras el bombardeo, el DNA se desprende de los microproyectiles, debido a las modificaciones del entorno iónico. De acuerdo con la localización de los microproyectiles en la célula, el DNA se puede integrar de forma estable en núcleo, cloroplastos o mitocondrias de las células vegetales, mediante recombinación al azar. Finalmente, los tejidos son colocados en condiciones adecuadas para la regeneración de plantas, mediante técnicas de cultivo de tejidos vegetales. Cabe anotar que los tejidos vegetales empleados son sometidos a un tratamiento osmótico pre y pos bombardeo, con el fin de evitar el daño de las células por el procedimiento (Taylor & Fauquet, 2002; Altpeter et al. 2005; Sanford, 2000; Rao et al. 2009).

Entre las desventajas que presenta este sistema, se encuentran: porcentaje de éxito variable; es frecuente la inserción de varias copias del casete de expresión variando desde 1 hasta 20, que pueden ir en tandem, causando silenciamiento génico; muchas veces no se consigue una introducción estable del transgen; se presentan rearreglos en el DNA transferido que difieren en tamaño; se puede presentar daño en los tejidos; el sistema es cotoso (Hansen & Wright, 1999; Veluthambi et al. 2003; Danilova, 2007).

[pic 1]

[pic 2]

Objetivo del estudio.

Se busca principalmente la introducción y expresión de genes extraños en tripanosomátidos para el estudio de los factores de regulación de genes que están relacionados con la patogenicidad de estos parásitos. Sin embargo, se busca un método alterno a la electroporación ya que este requiere demasiado ADN plasmídico. Así pues, la biobalística presenta una buena oportunidad para poder realizar la introducción del plásmido.

Metodología.

El plásmido pX, empleado en los experimentos, se derivó del gen amplificado de dihidrofolato reductasa-timidilato sintasa circular (DHFR-TS), presente en ciertas líneas metotrexateresistentes de Leishmania mnajor, con la región codificante de neomicina fosfotransferasa (NEO) Sustituida por la de DHFR-TS. El plásmido confiere resistencia al aminoglucósido G418 mediante la expresión de un ARNm NEO / -DHERTS quimérico, y generalmente reside como un episoma libre en las células transfectadas. Se recubrieron micropartículas de tungsteno (0,2 Am de diámetro medio, M5 Sylvania Inc.) con el ADN del plásmido mezclando secuencialmente en un tubo Eppendorf: 50 µL de micropartículas (60 mg / ml de solución madre en 50% de glicerol), 5 µl de ADN (0.6 µg / ml), 50 µl de CaCl2 (2,5 M), 20 µl espermidina de base libre (0,1 M). Después de una incubación de 10 minutos, las micropartículas revestidas de ADN se centrifugaron a 15,000 rpm y se eliminó el sobrenadante. El sedimento se lavó con 150 µl de etanol al 70% y con etanol absoluto al 100%, respectivamente.

La dihidrofolato reductasa-timidilato sintasa (DHFR-TS) es un folato bifuncional y una enzima metabolizadora de pirimidina.  El gen se compone de aproximadamente 1.560 pb y codifica un péptido de 58 kDa que contiene los dominios DHFR y TS ligados en una sola cadena polipeptídica. En Protozoos, ej. Trypanosoma brucei, esta enzima se expresa a partir de un único gen como un homodímero que comprende un dominio DHFR-N terminal fusionado a través de un péptido conector a un dominio TS en el extremo C-terminal. Por el contrario, DHFR y TS se expresan por separado de genes independientes en muchos otros organismos, incluidos los humanos. Se ha visto que DHFR-TS puede funcionar como un marcador positivo / negativo (Filho y Beverly 1996).

Los antifolatos muestran un efecto inhibitorio sobre la enzima DHFR-TS,  los cuales son un tipo de medicamento que impide a las células utilizar ácido fólico para elaborar ADN.​ Los antifolatos se utilizan en la quimioterapia del cáncer, algunos se emplean como antibióticos o agentes antiprotozoarios, siendo esto último posiblemente la razón más evidente del porqué de la utilización de este gen en el estudio de tripanosomáticos. El metotrexato es un análogo de ácido fólico, y debido a la similitud estructural con él, inhibe la enzima dihidrofolato reductasa, y por lo tanto impide la formación de tetrahidrofolato. Debido a que el tetrahidrofolato es esencial para la síntesis de purina y pirimidina, su deficiencia puede conducir a la inhibición de la producción de ADN, ARN, y proteínas.

...